РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментальные исследования проводились на базе отдела криоиммунологии
Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины.
Для достижения поставленных целей были использованы морфологические,
серологические, иммунологические, вирусологические, гистологические,
цитохимические, клинические и статистические методы исследования.
2.1. Материал и методы исследования, используемые в экспериментах по изучению
влияния гипотермического хранения до и после криоконсервирования, на свойства
ядросодержащих клеток и плазмы кордовой крови человека
Материалом для исследований служили образцы кордовой крови человека (14
образцов), полученные из материнского конца пуповины после отделения
новорожденных, родившихся в срок у здоровых матерей в условиях Областного
родильного дома №5 г. Харькова. Кровь отбирали в стерильные флаконы с
добавлением CPD (citrate-phosphatedexctrose anticoagulant), в соотношении 1:5,
при помощи одноразовых систем забора крови.
Гипотермическое хранение кордовой крови осуществляли в стерильных стеклянных
флаконах, в холодильнике с поддержанием температурного режима в пределах +4єС.
Замораживание крови проводили в одноразовых пластиковых контейнерах по
двухэтапной программе, оптимальной для стволовых кроветворных клеток [28] в
замораживателе УОП-6 до –196єС. На первом этапе кровь охлаждали со скоростью
1°С/мин с остановкой при -20°С в течение 20 минут, на втором – погружали в
жидкий азот.
Все известные в настоящее время методы криоконсервирования предполагают
использование криопротекторов. Отмывка клеток от криозащитных веществ оказывает
на них дополнительное травмирующее действие [5]. В связи с этим в данной работе
криоконервирование ядросодержащих клеток проводили в составе цельной кордовой
крови без использования традиционных криопротекторов, что значительно упростило
технологический процесс.
Отогрев материала осуществляли в водяной бане при температуре 40-41°С.
В зависимости от продолжительности гипотермического хранения кордовая кровь
человека была разделена на 8 следующих групп:
ККЧ1 – кровь, хранившаяся при +4оС в течение 24 часов;
ККЧ2 – кровь, хранившаяся при +4оС в течение 48 часов;
ККЧ3 – кровь, криоконсервированная после 24 часов предварительного
гипотермического хранения;
ККЧ4 - кровь, криоконсервированная после 48 часов предварительного
гипотермического хранения;
ККЧ5 – кровь, криоконсервированная после 24 часов предварительного
гипотермического хранения и хранившаяся после отогрева в условиях гипотермии в
течение 2 часов;
ККЧ6 - кровь, криоконсервированная после 24 часов предварительного
гипотермического хранения и хранившаяся после отогрева в условиях гипотермии в
течение 6 часов;
ККЧ7 – кровь, криоконсервированная после 24 часов предварительного
гипотермического хранения и хранившаяся после отогрева в условиях гипотермии в
течение 17 часов;
ККЧ8 – кровь, криоконсервированная после 24 часов предварительного
гипотермического хранения и хранившаяся после отогрева в условиях гипотермии в
течение 24 часов.
В нативных, криоконсервированых и подвергавшихся гипотермическому хранению
образцах крови проводили подсчет количества ядросодержащих и сохранных клеток,
количества колониеобразующих единиц в культуре (КОЕк), определяли клеточный
состав крови, популяции и субпопуляции лимфоцитов, моноцитов и стволовые
кроветворные клетки (морфологическим методом и с помощью моноклональных
антител), фагоцитарную активность ядерных клеток, а также
окислительно-восстановительный потенциал (НСТ-тест) и активность лизосомальных
ферментов (кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы) фагоцитов. До и после
криоконсервирования проводили изучение белкового спектра плазмы крови методом
гель-хроматографии и электрофореза.
Определение количества ядросодержащих клеток
Количество ядросодержащих клеток определяли в камере Горяева. Камеру заполняли
кровью из меланжера № 11, в котором предварительно при помощи 3% уксусной
кислоты разрушали эритроциты. Подсчет ядросодержащих клеток проводили при малом
увеличении микроскопа (объектив 8x, окуляр 15х) по общепринятой методике [47].
Определение количества сохранных клеток.
Количество сохранных клеток определяли с помощью экспресс-метода, путем
суправитального окрашивания суспензии клеток 2% водным раствором трипанового
синего. Под малым увеличением микроскопа (объектив 8x, окуляр 15х) проводили
подсчет 100 клеток. Поврежденные клетки окрашивались в голубой цвет [40, 53].
Приготовление, фиксация и окраска мазков крови
Мазки крови готовили на предметных стеклах с помощью более узкого шлифовального
стекла. После фиксации мазков в метаноле в течение 10 минут мазки высушивали и
окрашивали по Романовскому-Гимзе [36].
Методы выделения клеток
Для определения популяций и субпопуляций лимфоцитов при помощи моноклональных
антител, лимфоциты до криоконсервирования выделяли в градиенте плотности
фиколл-верографин. В центрифужные пробирки, содержащие 3 мл смеси
фиколл-верографина плотностью 1,076-1,078, наслаивали 7 мл крови, разведенной
1:3 рингер-фосфатным буфером (РФБ) с рН 7,4, и центрифугировали в течение 40
минут при 1500об/мин. В результате центрифугирования эритроциты и гранулоциты
оседали на дно пробирки, а на границе разделения фаз формировалось кольцо
лимфоцитов. Этот слой клеток отбирали пипеткой и дважды отмывали РФБ путем
центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 минут.
Выделение ядросодержащих клеток для определения их фагоцитарной активности в
нативных образцах проводили с помощью раствора желатины. Метод основан на
способности
- Київ+380960830922