Ви є тут

Особливості селективності та проникності клонованих кальцієвих каналів Т-типу

Автор: 
Щегловітов Олександр Костянтинович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2007
Артикул:
0407U000041
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Приготовление мРНК
Матричную РНК (мРНК) для инъекции в ооциты получали путем in vitro-транскрипции с помощью транскрипционного набора T7 mMessage mMachine Kit ("Ambion", США) из комплементарных ДНК (кДНК). Человеческая ?1H- и крысиная ?1G-субъединицы (GenBankTM/EBI, инвентарные номера NM_021098 и AF027984 соответственно), субклонированные в pGEM-HEA-векторе, были линеаризированы с помощью AflII рестриктазы, а ?1I-субъединица (NM_020084) - в pSP73-векторе, с помощью EcoRI. Плазмиды с клонами трёх подтипов НПКК были любезно предоставлены нам д-ром Э. Пересом-Реесом из Университета Вирджинии (США).
2.2 Система трансляции в ооцитах - универсальный инструмент исследования функциональной экспрессии канальных белков
Быстрое развитие методов молекулярной биологии и биохимии способствовало появлению работ по выделению, очистке, расшифровке аминокислотной последовательности канальных белковых молекул, определению их субъединичного состава и реконструированию подобных молекул в искусственную мембрану [27,32,47,73]. Клонирование кДНК (комплиментарной ДНК) ионных каналов позволяет получать и функционально анализировать редкие или белки канальных молекул. В результате появилась возможность изучать биогенез кальциевых каналов (экспрессию генов и ее регуляцию, трансляцию, пострансляционные модификации, встраивание каналов в мембрану); выявлять участки в структуре канала, ответственные за ту или иную его функцию; анализировать связь отдельных субъединиц канала между собой и другими компонентами мембраны, а также проводить сравнительные исследования разных подтипов кальциевых каналов и их субъединиц [32,67,87,106-108,117,193].
Для этой цели широко используются ооциты шпорцевой лягушки Xenopus laevis (рис. 2.2.1). Когда в целую клетку инъецируют раствор ДНК (в ядро) или РНК (в цитоплазму), составляющий примерно 1% объема клетки, молекулы деградируют совсем незначительно. Поэтому микроинъекция в ооциты ДНК и РНК является важным и полезным методом функционального анализа канальных белков.
Ядро ооцита содержит достаточное количество эукариотических РНК-полимераз, чтобы удовлетворить потребности развивающегося эмбриона до стадии 30000 клеток. Этот материнский запас может использоваться также для транскрипции [80], репликации, самосборки, распределения и трансляции [41] инъецированных макромолекул ДНК. Еще в начальных экспериментах на ооцитах было показано, что инъецированная в них генетическая информация действительно транскрибируется. Позже установили, что инициация и терминация транскрипции зкзогенной ДНК осуществляется правильно. Затем было проведено множество экспериментов по инъекции самых различных ДНК [81,140,147,151,158,159,227,228]
Больше всего работ в этой области посвящено трансляции в ооцитах инъецированной мРНК. Впервые это было сделано Джоном Гардоном и его коллегами [80], которые наблюдали синтез глобинов после инъекции 9S РНК из ретикулоцитов кролика. С тех пор было транслировано с помощью инъекции в ооциты множество РНК самых различных организмов, начиная
Рис. 2.1.1. Строение ооцита.
от вирусов и беспозвоночных и заканчивая растениями и позвоночными [14,54,59,75,143,150,163,190,196,223]. При этом многие белки подвергались посттрансляционным модификациям: NH2-ацетилированию и N-гликозилированию [41], гидроксилированию [135], фосфорилированию, расщеплению полибелка и ковалентной [219] и нековалентной сборке субъединиц [207] удалению сигнальной последовательности [41,219]. Синтезируемые белки обладали способностью встраиваться в те внутриклеточные мембраны, для которых они предназначены.
Впервые использование ооцитов для исследования синтеза и биологической активности мембранных белков и ионных каналов в сочетании с методами электрофизиологической регистрации интегральных электрических токов и токов микроучастков мембраны(пэтч-клэмп) было применено в работе Гундерсена, Паркера и Миледи [76], после которой появилось много работ посвященных данному вопросу [4,77-79,102,174]. Инъецируя мРНК из мозга млекопитающих в ооциты, авторы электрофизиологически зарегистрировали появление в мембране инъецированных ооцитов серотонин- и каинат-чувствительных каналов. Для доказательства экзогенной природы появившихся каналов использовали актиномицин Д, подавляющий транскрипцию.
2.2.1 Выделение ооцитов
В опытах использовались зрелые самки лягушки Xenopus laevis, яичник которых содержит, как правило, около 30.000 крупных ооцитов диаметром более 1 мм. Самку анестезировали, погрузив ее на 15-30 минут в 0,1%-ный раствор этиламинбензоата в воде. Затем ее помещали на плоскую поверхность и делали небольшой надрез (около 1 см) с брюшной стороны через свободно прилегающую кожу и стенку брюшной полости в задней части тела (рис. 2.2.2). В результате этой операции открывался доступ к яичнику, расположенному в брюшной полости и состоящему из 16 долей.
С помощью обычного пинцета отделяли одну долю яичника и накладывали у ее основания лигатуру. Выбранную долю отрезали ножницами и переносили в модифицированный солевой раствор Барта содержащий (в мМ/л): NaCl-88, KCl-1, NaHCО3-2.4, Ca(NO3)2-0.3, CaCl2 -0.41, MgSO4-0.82, HEPES-15, pH доводили NaOH до 7.4. Также в этот раствор добавляли 50 мкг/мл гентамицина. На стенку брюшной полости и кожу по отдельности накладывались швы. После этого лягушку оставляли
Рис. 2.2.2. Выделение ооцитов.
приходить в нормальное состояние на 24 часа в наклонном резервуаре, частично заполненном водой
2.2.2 Подготовка ооцитов к инъекции
С целью длительного сохранения жизнеспособности ооцитов, фрагменты яичника тщательно промывали в стерильном солевом растворе Барта сразу после извлечения из лягушки. С помощью пинцета и ножниц разделяли долю яичника на отдельные ооциты. После этого ооциты ферментативно обрабатывали в безкальциевом солевом растворе OR-2 следующего состава (в милимолях на 1 л): NaCl - 82.5, KCl - 2.0, MgCl2-1.0, HEPES - 5.0 (pН = 7.5) с добавлением 2 мг/мл коллагеназы (тип