Ви є тут

Клініко-експериментальне обґрунтування лікування ураження зорового аналізатора при ремітуючому типу розсіяного склерозу (клініко-експериментальне дослідження)

Автор: 
Мельник Володимир Олексійович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2007
Артикул:
0407U000770
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ СТРУКТУРИ І ФУНКЦІЇ ЗОРОВОГО АНАЛІЗАТОРА ПРИ ДЕМІЄЛІНІЗУЮЧИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ
2.2. Матеріали і методи експериментальної частини дослідження
2.2.1. Методика індукції експериментального алергічного енцефаломієліту
Експериментальна частина дисертаційної роботи була виконана на білих нелінійних щурах однієї статі - самках (Rattus norvegicus L.). Демієлінізацію, ремієлінізацію нервових волокон, а також структурні зміни нервової тканини потиличної кори головного мозку тварин вивчали на загальновизнаній експериментальній моделі - експериментальному алергічному енцефаломієліті (ЕАЕ). Ініціацію ЕАЕ проводили, опираючись на роботу авторів, що базувалась на одноразовому введенні у подушечки лап тварин гомогенату спинного мозку(50мг на 100г маси) з додаванням повного ад'юванта Фрейнда [23, 36, 37, 40].
Тяжкість хвороби оцінювали за шкалою: відсутність клінічних проявів - 0 балів; зниження тонусу хвоста - 1 бал; слабкість або легкий параліч задніх кінцівок - 2 бали; важкий параліч задніх або всіх чотирьох кінцівок - 3 бали; передсмертний стан - 4 бали; смерть - 5 балів [36, 40].
Дослідження проводилось на 30 щурах масою 200г. Всі тварини були розділені на 4 групи: перша група - 12 дослідних щурів, які протягом 5 діб (з 12 по 16 добу) після індукції ЕАЕ, отримували ін'єкції препарату "Імуноглобулін людини нормальний для внутрішньовенного введення" в дозі 0,5г/кг; друга група - 8 дослідних щурів, які протягом 5 діб (з 12 по 16 добу) після індукції ЕАЕ, отримували ін'єкції очищеного імуноглобуліну щура в дозі 0,5г/кг; третя група - 7 щурів - контрольні; четверта група - 3 щури - інтактні. Контрольними були щури з ЕАЕ, що не отримувану імуномодулюючої терапії. Очищений імуноглобулін щура одержували методом сольового висалювання сірчанокислим амонієм. Забір матеріалу у тварин для світлооптичної та електронної мікроскопії проводили на 17 і 30 добу після індукції експериментального алергічного енцефаломієліту. З відповідною метою, усі тварини з ЕАЕ з кожної групи були розподілені на дві половини. На 17 добу дослідження був взятий матеріал дослідження у першої половини тварин, а на 30 добу - у другої.
Розподіл експериментальних і контрольних тварин за серіями дослідів приведений у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Розподіл дослідних, контрольних і інтактних тварин за серіями досліду.
Кількість дослідних щурів17 доба після індукції ЕАЕ30 доба після індукції ЕАЕДослідна група Щури, яким з 12 по 16 добу після індукції ЕАЕ здійснювали ін'єкції "Імуноглобуліну людини нормального для внутрішньовенного введення" в дозі 0,5г/кг 6 6Щури, яким з 12 по 16 добу після індукції ЕАЕ здійснювали ін'єкції очищеного імуноглобуліну щура в дозі 0,5г/кг 44Контрольна група - щури з індукованим ЕАЕ, що не отримували імуномоделюючої терапії43Інтактні щури 3
Тварини утримувались у стандартних умовах віварію з вільним доступом до кормів та води. Утримання і маніпуляції з ними проводились у відповідності до положень "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах", які були ухвалені на першому Національному конгресі з біоетики (Київ,2001) та вимог додатку 4 до "Правил проведення робіт з використанням експериментальних тварин", затвердженим Наказом Міністерства охорони здоров'я СРСР №755 від 12.08.1977 року "Про заходи щодо подальшого удосконалення організації форм роботи з використання експериментальних тварин". Евтаназію експериментальних тварин здійснювали шляхом передозування інгаляційного наркозу повітряною сумішшю стабілізованого етилового ефіру.

2.2.2. Методика введення внутрішньовенних імуноглобулінів
З 12 по 16 добу дослідній групі тварин проводили імуномодулююче лікування шляхом внутрішньоочеревинного введення "Імуноглобуліну людини нормального для внутрішньовенного введення" та очищеного імуноглобуліну щура відповідно попередньому розподілу. У дослідних тварин внутрішньоочеревинний спосіб введення препарату прирівнюється до внутрішньовенного [137]. Розрахунок дози препаратів проводився згідно прийнятих доз для лікування розсіяного склерозу - 0,2-0,4г/кг. Таким чином, для еквівалентного терапевтичного ефекту шляхом перерахунку щурам була визначена доза введення препарату 0,5-1,0г/кг [137]. Нами була вибрана доза 0,5г/кг.

2.2.3. Світлооптичні методи дослідження
Об'єктами світлооптичного дослідження з наступним морфометричним аналізом були органи ЦНС - потилична кора головного мозку щурів. Забір, фіксація, ущільнення та виготовлення парафінових блоків зі зразками нервової тканини проводили згідно загальноприйнятих правил [53]. Парафінові зрізи, товщиною 4-6мкм отримували за допомогою роторного автоматичного мікротому НМ360 (Carl Zeiss Jena Gmb).
Зрізи забарвлювали діамантовим крезиловим фіолетовим, толуїдиновим блакитним за Нісслем [78, 121, 181].

2.2.4. Електронномікроскопічні дослідження зорового нерва

Забір матеріалу і приготування препаратів для електронно-мікроскопічного дослідження проводились згідно загальноприйнятих правил [7]. Безпосередньо після припинення дихання виділяли зоровий нерв через порожнину черепа шляхом розкриття зорового каналу крилоподібної кістки , розділяли його на фрагменти довжиною 0,5мм? і занурювали у фіксуючу суміш, яка складалась з 2,5% глютарового альдегіду на фосфатному буфері, протягом 1 години; або 1% чотириокисом осмію за Колфілдом протягом 2 годин на холоді. Зневоднення проводили в етиловому спирті зростаючої концентрації починаючи з 70%, проводили через ацетон та заливали у суміш Epon та Araldit M (виробництво Fluka AG, Швейцарія) за загальноприйнятою методикою [7]. Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі LKB-8800 (Швеція). Попередньо контрастували зрізи у 2%-му розчині ураніл ацетату, в 70% етанолі протягом 15 хвилин і цитратом свинцю стільки ж часу. Надалі зрізи вивчали та фотографували на електронних мікроскопах ЭМ 125К та ЭМВ 100Б.

2.2.5. Морфометричні методи дослідження

Отримані результати досліджували