РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Аварія на Чорнобильській АЕС - найбільша радіоекологічна катастрофа сучасності [79, 87, 104, 163, 180, 225]. Наслідки цієї катастрофи і досі вимагають вивчення прикладних аспектів в екології [13, 50, 90, 128, 155, 181]. За даними Новомосковської геолого-розвідувальної експедиції в 1991 році виявлено в деяких районах України підвищення радіоактивного фону на 15-20%, збільшення в 2-2,5 рази вмісту в воді та грунті солей міді, кобальту, цинку, хрому, марганцю і свинцю. Оскільки чутливість клітин і тканин до іонізуючого випромінювання у тварин-ссавців та людей однотипні, а ефект від його дії подібний, це дає змогу інтерпретувати отримані результати експериментальних досліджень, проведених на тваринах, на людей. Причому вивчення морфологічних змін, спричинених опроміненням та дією підвищенних доз солей важких металів, доцільніше проводити на нирках щурів, тому що нирка щура складається з однієї частини, яка за своєю будовою аналогічна частці нирки людини [66].
Для проведення експериментальних досліджень було використано 180 білих лабораторних щурів-самців трьохмісячного віку масою 70-90 г, які знаходились в стаціонарних умовах віварія. 30 особин були залишені інтактними та склали контрольну серію. Інші щури (150) були поділені на 3 експериментальні серії, на яких моделювався вплив екологічних факторів, зазначених в таблиці 2.1. Досліди здійснювалися відповідно до "Правил проведення робіт з експериментальними тваринами" [66].
І серія (30 щурів) - загальне опромінення на установці "Rocus" (енергія квантів 1,25 МеВ, потужність дози 60 Р/хв). Перша група тварин (R1) отримувала одноразово опромінення у дозі 0,1 Гр. Друга група тварин (R2) опромінювалась двічі у дозі 0,1 Гр з інтервалом в тиждень. Загальна доза опромінення - 0,2 Гр. Третя група тварин даної серії (R3) інтервалом в 1 тиждень опромінювалась тричі у дозі 0,1 Гр. Загальна доза опромінення - 0,3 Гр. Ці дози вважаються низькими [24, 153].
Таблиця 2.1
Розподіл тварин по серіях і групах досліджень
№ групиІ серіяІІ серіяІІІ серіяІнтактніR1R2R3C1C2C3R1+R2+R3+4м5м6мC1C2C3C1C2C3C1C2C31101010210101010103101010101041010101010
ІІ серія (30 щурів) - навантаження солями важких металів. Дози металів відповідали даним Новомосковської експедиції (1991 рік): міді (CuSO4?5H2O) - 1 мг/л, свинцю (Pb(CH3COO)2) - 0,25 мг/л, цинку (ZnSO4?7H20) - 12 мг/л, хрому (К2CrO7) - 0,2 мг/л, марганцю (MnSO4?5H2O) - 0,2 мг/л.
Перша група тварин (С1) одержувала вільно з питною водою солі важких металів протягом 1 місяця, друга група (С2) - протягом 2-х місяців, третя група (С3) - протягом 3-х місяців.
ІІІ серія (90 щурів) - сумісний вплив загального опромінення і солей важких металів у дозах і термінах зазначених у І і ІІ серіях експерименту.
Інтактні щури (30) були розбиті на 3 групи (4, 5 і 6 місяців) по 10 тварин у кожній, що відповідає віку експериментальних тварин на момент закінчення експерименту (див. табл. 2.1.).
Експеримент і вилучення нирок для досліджень проводили у літній період, в один і той же час доби між 10.00 та 12.00 у спеціальному приміщенні при t0 оточуючого повітря 180-200С. Підготовка тварин до експерименту та виведення з досліду здійснювали згідно з наказом "Про міри по подальшому вдосконаленню організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин".
Після закінчення експерименту тварин зважували на технічних вагах, знечулювали ефірним наркозом та забивали шляхом декапітації. Для проведення досліджень забиралися нирки. Одна з нирок (права) зважувалася на електронних вагах, проводили обчислення її відносної маси на 100 г ваги за формулою:
Мн?100 (2.1)
М відн = ------------------,
Мт
де М відн - відносна маса нирки;
Мн - маса нирки даного щура;
Мт - маса тіла даного щура.
Для гістологічних досліджень одразу після видалення нирки і зважування вирізали шматочки товщиною 5 мм. Матеріал фіксували протягом 2-3 тижнів в 10% розчині нейтрального формаліну з трьохразовою зміною фіксатора, потім зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації, після чого заливали у парафінові блоки. Зрізи, товщиною 5-6 мкм, забарвлені гематоксилин-еозином, досліджували у світлооптичному мікроскопі "Olimpus" і документували за допомогою цифрової мікровідеокамери. Цей метод дає можливість вивчати структуру тварин у нормі, а також характер і глибину морфологічних змін при впливі чинників зовнішнього середовища.
Забір матеріалу для електронно-мікроскопічних досліджень компонентів нирки проводили згідно загальноприйнятих правил. Для дослідження вирізали маленькі шматочки тканини з середньої частини кіркової речовини нирки. Матеріал фіксували у 2,5 % розчині глютаральдегіду з активною реакцією середовища Ph 7,3-7,4 приготовленому на фосфатному буфері Міллоніга. Фіксований матеріал через 50-60 хвилин переносили у буферний розчин і промивали протягом 20-30 хвилин. Постфіксацію матеріалу здійснювали 1% розчином чотириокису осмію на буфері Міллоніга протягом 60 хвилин, після чого проводили його дегідратацію в спиртах і ацетоні та заливали в суміш епоксидних смол. Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомі, забарвлювали 1% розчином уранілацетату, контрастували згідно методу Рейнольдса та вивчали в електронному мікроскопі ПЭМ - 100К.
Морфометричні і кількісні дослідження проводили, використовуючи систему візуального аналізу гістологічних препаратів. У визначені терміни досліду в препаратах забарвлених гематоксилином та еозином за допомогою окуляр-мікрометричної лінійки [2, 46] і за допомогою світового мікроскопа "Olimpus" з цифровою відеокамерою та пакетом прикладних програм "Видео тест 5,0" та "Видео размер 5,0". Зображення зберігали на вінчестері, з наступним друком кольорових ілюстрацій