РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Враховуючи мету і завдання наукового дослідження нами був вибраний наступний методологічний підхід та комплекс лабораторних методів дослідження.
2.1. Реактиви та матеріали
Синтетичні субстрати: n-нітроанілід Na-бензоїл-Д,L-аргінін (БАПНА) ("Fluka" Швейцарія), 3?,5?-діамінбензойна кислота (3?,5?-ДАБК) ("Fluka" Швейцарія), акридиновий оранжевий ("Sigma" США), С14-НАД+ ("Amersham" Англія), "АТР Monitoring Kit" ("Sigma" США), алкогольдегідрогеназа ("Reanal", Угорщина), Caspase Colorimetic Protease Assay Sampler Kit (Caspases3) ("BioSourse", США), n-нітроанілін ("Sigma" США), флуоресцеінізотіоціанат ("Sigma" США)
2.2. Умови проведення експерименту
Досліди проводили на білих нелінійних щурах-самцях масою 150-170 гр. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. З метою попередження можливого впливу добових ритмів на досліджувані показники досліди проводили в один і той же час доби. Всі експерименти на тваринах здійснювали у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин".
Препарат рибоксин у вигляді 2% водного розчину вводили за 15 хв до опромінення внутрішньочеревинно з розрахунку 150 мг препарату на 1 кг маси тварини. Опромінення здійснювали на рентгенівській установці РУМ-17 в дозах 1,0 Гр та 7,78 Гр за умов: фільтри 0,5 мм Си та 1 мм Аl, шкірно-фокусна відстань 50 см, напруга 200 кВ, сила струму 5 мА для 1,0 Гр і 10 мА для 7,78 Гр, потужність дози у повітрі 0,17 Гр/хв та 0,34 Гр/хв відповідно. Тварин декапітували через 30 хвилин і 3 години після опромінення та видаляли тимус і селезінку.
2.3. Метод виділення лімфоїдних клітин тимуса і селезінки та визначення їх життєздатності
Лімфоцити тимуса виділяли згідно з методом, описаним у [68].
Тимус очищали від сполучної тканини і ретельно перетирали через нейлонову сітку з відповідним розміром пор у розчині Хенкса з 0,01М трис-HCl, рН 7,4. Клітини відмивали у середовищі виділення 2 рази з подальшим центрифугуванням при 200g протягом 5 хв.
Очищену від сполучної тканини селезінку (600 мг) подрібнювали у чашці Петрі у розчині Хенкса з 0,01 М трис-HCl, pH 7,4 з наступним перетиранням через чотири шари нейлону. Після десятихвилинного відстоювання надосадову рідину наносили на градієнт щільності Ficoll-Paque (густина - 1,077г/см3 ) за методом [85]. Вміст центрифугували впродовж 40 хв при 1000g після чого клітинну суспензію на межі розподілу фаз обережно відбирали за допомогою пастерівської піпетки та двічі відмивали у середовищі виділення.
Кількість одержаних клітин підраховували, використовуючи камеру Горяєва. Контроль числа лімфоїдних клітин, що загинули, проводили після профарбовування суспензії клітин барвником трипановим синім.
2.4. Оцінка структурного стану ядерних нуклеїнових кислот лімфоцитів тимуса і селезінки щурів
З метою біохімічної оцінки стану флуорохромованої ДНК ядер фіксованих клітин проводили їх мікроскопію. Аліквоту з отриманої фракції лімфоїдних клітин наносили на покривне скельце і фіксували сумішшю Карнуа (етанол, хлороформ, льодяна оцтова кислота- 6 : 3 : 1). Підсушені при кімнатній температурі мазки профарбовували у буфері з використанням барвника акридинового оранжевого (АО) протягом 15 хв. Надалі застосовували розроблену Брітом І.С. методику зйомки та обробки клітин ?12?. Виконували двохвильову послідовну фотометрію кольорових зображень (фотознімків) біологічних об'єктів, одержаних з використанням цифрової фотокамери "Olympus" С-2000 Zoom, встановленої на люмінесцентному мікроскопі фірми Carl Zeiss Iena (Німеччина). Програма автоматично розраховувала співвідношення інтенсивностей люмінесценції вимірюваних зон клітин у червоній (640 нм) і зеленій (530 нм) областях спектру (точність: ?+0,05) та будувала графіки за параметром ? ??=І640 / І530?, який відповідає інтегральному показнику ступеня спіралізації ядерного хроматину та стану синтетичного апарату клітини.
2.5. Визначення активності ендогенних протеїназ лімфоцитів тимуса та селезінки щурів
Лімфоїдні клітини (2?107клітин) ресуспендували у щільно притертому гомогенізаторі Поттера в 20 об'ємах буфера, який містив: (0,1 М трис-НСl, рН 8,5; 0,05 М NaCl; 0,05% тритон Х-100 ).
Протеолітичну активність визначали флуоресцентним методом згідно з ?40?.
Як субстрат використовували казеїн з флуоресцентною міткою (флуоресцеінізотіоціанат). До 0,1 мл гомогенату додавали 2,5 мл 0,5 М боратного буфера рН 8,8, з 0,15 М NaCl та 0,2 мл казеїн-флуоресцеінізотіоціанату. Проби інкубували при 37?С протягом 4 годин. Реакцію зупиняли додаванням 5% ТХО.
Флуоресценцію вимірювали на спектрофлуориметрі Shimadzu RF-150 при довжині хвилі збудження 490 нм та емісії 525 нм.
Приготування казеїн-флуоресцеінізотіоціанату проводили згідно ?173?. 1 г казеїну розчиняли у 100 мл 0,05 М карбонатного буфера, рН 9,5, що містив 0,15 М NaCl. До розчину додавали 40 мг флуоресцеінізотіоціанату, суміш перемішували при кімнатній температурі протягом години. Далі проводили діалізи: в 2 л дистильованої води при 4?С; потім проти 0,05 М трис-HCl буфера, рН 7,2. Після центрифугування проб при 400g протягом 10 хв, осад розчиняли в 0,05 М трис-HCl буфері, рН 7,2.
2.6. Визначення активності катепсину В у тимоцитах та спленоцитах щурів
Активність катепсину В визначали згідно з методом [71].
Клітинну суспензію (2Ч107 клітин) осаджували шляхом центрифугування при 200g протягом 5 хв. Одержаний осад обережно ресуспендували у буфері, що містив 0,02М трис-HCl, 0,005 М MgSO4, рН 7,2, та 0,05 мл 0,008% дигітоніну з подальшою інкубацією проб при 40С впродовж 20 хв. Після чого до проб додавали 0,001 М ЕДТА та поміщали на 10 хв у водяну баню (370С). По закінченні інкубації у пробірки послідовно додавали 0,2 М натрій-фосфатний буфер, рН 6,0 та 0,1 мл 0,065 М розчину ?-бензоїл-D,L-аргінін-n-нітроаніліну (БАПНА). Ретельно перемішавши, проби інкубували на водяній бані впродовж 60 хв. Реакцію зупиняли додаванням 25% Т