РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Исходный материал
Работа выполнялась в лаборатории культуры тканей Южного биотехнологического
центра в растениеводстве УААН и МОН в 2002-2005 годах. В исследованиях
принимали участие сорта, гибридные популяции F1 и F2, а также гомозиготные
линии ярового ячменя (Hordeum vulgare L.), различающиеся по степени
устойчивости к мучнистой росе – Erysiphe graminis DC. f. sp. hordei Marschal.
Растительный материал любезно предоставлен отделом селекции и семеноводства
ячменя Селекционно-генетического института – Национального центра семеноводства
и сортоизучения УААН. Для проведения экспериментов растения-доноры культурного
ячменя выращивали в полевых условиях в 2003-2005 годах, а также в условиях
оранжереи при интенсивности освещения 7-8 тыс. лк., 16-ти часовом фотопериоде и
температуре 15 - 20 оС.
Для культуры пыльников в качестве исходного материала использовали сорта
ярового ячменя Чаривный, Казковый, Селенит, которые согласно результатам
фитопатологической оценки имели высокие баллы устойчивости к E. graminis
(Чаривный – 8 баллов; Казковый – 9 баллов; Селенит – 8 баллов) [236]; гибриды
F1: Казковый х Селенит, Чаривный х Селенит, Чаривный х Казковый, гибриды F2:
Гетьман х Astoria и Гетьман х Madonna, созданные с участием сортов иностранной
селекции, отличающиеся комплексной устойчивостью к заболеваниям надземной части
растения, а также коллекционная гомозиготная линия из сорта Одесский 100.
Сложные гибриды (Казковый х Селенит) х Одесский 100, (Чаривный х Селенит) х
Одесский 100, (Чаривный х Казковый) х Одесский 100 созданы нами в течение
вегетационного периода 2004 года.
Для выполнения экспериментов по получению межвидовых гибридов в качестве
материнских форм использовали следующие генотипы культурного ячменя: гибриды F1
(94-97-21 х Чудовый) и F1 (93-214-31 х Чудовый), гибриды F2: Гетьман х Astoria
и Гетьман х Madonna, любезно предоставленные отделом селекции и семеноводства
ячменя СГИ; гибриды F1: (Чаривный х Селенит), (Чаривный х Казковый) и (Казковый
х Селенит), созданные нами в лаборатории культуры тканей. В качестве отцовской
формы были взяты многолетние, дикорастущие, луковичные формы Hordeum bulbosum
L. (2n = 14) и Hordeum bulbosum L. (2n = 28) коллекции ЮБЦ.
Работу по получению соматических регенерантов с повышенным уровнем устойчивости
к мучнистой росе выполняли на незрелых зародышах (14 суток после опыления) двух
линий из сортов ярового ячменя, восприимчивых к мучнистой росе – Одесский 100
(3 балла) и Экзотик (3 балла) и двух линий ярового ячменя с устойчивостью к
данному возбудителю заболевания – гомозиготная линия из гибрида Гетьман х
Madonna (ГМ-1) (7 баллов) и линия ДГ-1 (8 баллов), полученная в результате
скрещивания гибирида F1 (94-97-21 х Чудовый) х H. bulbosum (2n = 14).
2.2. Методика исследований
Изолирование пыльников проводили из колосьев с микроспорами, находившимися в
фазе сильной вакуолизации. Определение фазы развития микроспор проводили на
временных препаратах, окрашенных ацетокармином под микроскопом фирмы Opton.
Колосья без предварительного извлечения из листового влагалища стерилизовали
70% этанолом в течение 30-45 секунд. Далее в количестве 6-7 штук в асептических
условиях их помещали в чашки Петри диаметром 95 мм с каплей стерильной
дистиллированной воды для поддержания влажности и запечатывали парафильмом. Для
определения оптимальных условий холодовой обработки микроспор чашки Петри
хранили в холодильнике при температуре 4оС в течение 7, 10, 19, 28 и 33 суток.
Также проводили обработку изолированных колосьев при температуре 4оС в 0,3 М
растворе маннитола в течение 7 суток, с последующей обработкой при повышенной
влажности 3 суток.
Высадку пыльников на питательные среды проводили в асептических условиях. С
целью подбора оптимального состава питательной среды для культивирования
изолированных пыльников ячменя, использовали среду 190-2 [101] и питательную
среду разработанную A. Jahne Gartner & H. Lorz [102]. Инкубацию пыльников
проводили в термостате в темноте при температуре 24оС на протяжении 28-35
суток. Цитологические наблюдения за развитием микроспор во время
культивирования пыльников на питательной среде проводили со 2-х по 28-е сутки
на временных, окрашенных ацетокармином препаратах под микроскопом фирмы Opton.
Пыльники с видимыми новообразованиями на поверхности считали морфогенными.
Частоту индукции новообразований (эмбриодов и каллуса) в морфогенных пыльниках
определяли относительно количества высаженных пыльников и выражали в процентах.
Новообразования переносили на модифицированную нами питательную среду MS [100].
Культивирование новообразований проводили под рассеянным светом (2,5-3,5 тыс.
лк.) при температуре 22-24оС и 16-ти часовом фотопериоде до появления
регенерантов. Полученные регенеранты переносили в сосуды с почвой и выращивали
в условиях оранжереи при 16-ти часовом фотопериоде с интенсивностью освещения
3,5 тыс. лк. и температуре 15-20оС. Частоту регенерации растений оценивали
относительно количества морфогенных пыльников и выражали в процентах.
Гибридизацию культурных форм ячменя H. vulgare с H. bulbosum проводили на
опытном участке ЮБЦ. Клоны дикорастущего ячменя H. bulbosum изучали по
следующим показателям: количество хромосом на метафазе І микроспорогенеза
(определяли по стандартной методике Паушевой [238]), срок и продолжительность
цветения, способность к скрещиваниям с генотипами культурного ячменя,
устойчивость к мучнистой росе. Интенсивность поражения побегов исследуемых форм
грибным патогеном, определяли в полевых условиях визуально и учитывали по шкале
оценок устойчивости зерновых и
- Київ+380960830922