РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
При виборі стратегії застосування конкретних експериментальних методик виходили з мети та окремих задач, сформульованих в роботі. Оскільки головним предметом досліджень даної роботи є розробка методу біосинтезу ІФН І типу з застосуванням комплексних полінуклеотидних індукторів, іммобілізованих на нерозчинних гранулярних носіях, потрібно було штучно створити оптимальні фізіологічні умови для клітин-продуцентів, які сприяли б ефективній інтерфероногенній дії вказаних індукторів.
2.1. Об'єкти досліджень та матеріали, що використовувалися у роботі
В роботі використовувалися об'єкти двох типів: біотичні - клітини-продуценти ІФН І типу, та абіотичні - системи культивування, i складові процесу інтерфероногенезу.
2.1.1. Індуктори інтерферонів І типу, що досліджувалися
В якості індукторів ІФН І типу використовувались інтерфероногенні молекулярні комплекси, у яких полінуклеотидна складова ковалентно з'єднувалася з гранулярним нерозчинним носієм (ІММК). Компонентами ІММК слугували дріжджова РНК (НПО "Біохімреактив", Олайна, Латвія) та гідрохлорид тилорону ("Sigma", США). Препарат дріжджової РНК додатково очищали потрійною фенольною депротеїнізацією з подальшим осадженням етанолом згідно стандартної методики [67].
Індукторами порівняння в дослідах слугували вільні молекулярні комплекси дріжджова РНК-тилорон (МК), вільний гідрохлорид тилорону, а також як вільні, так і іммобілізовані на тих же гранулярних носіях ридостин (длРНК дріжджів S. cerevisiae, НПО "Вектор", Росія) та poly(I)-poly(C) ("Calbiochem", США).
2.1.2. Носії для ковалентного зв'язування полінуклеотидних
компонентів індукторів інтерферонів
У якості нерозчинних гранулярних носіїв для ковалентного зв'язування полінуклеотидних компонентів індукторів ІФН використовувалися Cефадекс (Sephadex G-50 Medium 50-150 мm "Pharmacia", Швеция), Cефароза (Sepharose 4B, 60-140 мm, "Pharmacia",) та Cферон (Spheron 300 (LC) 63-100 мm "Lachema", Чехія).
2.1.3. Хімічні реактиви, що використовувались в роботі
В роботі використовували Na-ЕДТА (версен) ("Serva", Німеччина), бромціан ("Sigma", США), трис-(гідроксиметил)амінометан ("Sigma", США), орцин ("Sigma", США), 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазиноетансульфонова кислота (HEPES) ("Serva", Німеччина), "Phicoll-400" Mr = 4?105 Da ("Pharmacia", Швеція), "Trasograph" (діатрізоат меглумін натрій, 76%, Unic pharmaceuticals labs", Індія) та трипановий синій ("Біолот", Росія).
Прості хімічні сполуки, що використовувалися в роботі (табл. 2.1.3.1), за виключенням ряду відмічених випадків, застосовували без додаткової очистки.
Таблиця 2.1.3.1
Прості хімічні сполуки, що використовувалися в роботі
СполукаКлас
чистотиДодаткова
очистка123HClч.д.а.-КOHх.ч.-
Продовж. табл. 2.1.3.1
123NaClо.с.ч.-Na2HPO4ч.-NaH2PO4ч.-Na2CO3Ч10H2Oч.-NaHCO3ч.-FeCl3Ч6H2Oч.-CaCl2ч.-MgCl2?6H2Oч.-МgSO4ч.-NH4Clч.-Хлороформч.перегонкаЕтанол, 96%ч.подвійна перегонкаСірчаний ефірч.-Трихлороцтова кислота (ТХО)ч.-Глюкозах.ч.-
2.1.4. Буферні та інші розчини реактивів
Для приготування таких розчинів наважки солей розчиняли у бідистиляті з наступним фільтруванням. За необхідності проводили стерилізацію розчинів автоклавуванням при 0,15 МПа (121°С) протягом 20 хв.
Фосфатно-сольовий буфер (Дюльбеко) готували на ізотонічному розчині NaCl з додаванням солей фосфатного буферу. Розчин використовували для приготування МК, інших полірибонуклеотидних індукторів, промивання клітин, тощо.
Склад: NaCl - 8,0 г, КCl - 0,20 г, Na2HPO4 - 1,15 г, КH2PO4 - 0,20 г, CaCl2 - 0,10 г, MgCl2?6H2O - 0,10 г, води дистильованої до 1,0 л (рН=7,6). Розчини CaCl2 та MgCl2?6H2O стерилізували окремо.
0,02 % розчин версену використовували для зняття моношарових культур з поверхонь.
Склад: NaCl - 12,0 г, КCl - 0,30 г, Na2HPO4 - 3,93 г, КH2PO4 - 0,03 г, Na-ЕДТА - 0,30 г, води дистильованої до 1,5 л.
Розчин фікол-урографіну. 4,5 г фіколу розчиняли в 50 мл гарячої води. Додавали 20 мл розчину для урографії "Trasograph". Компоненти змішували до отримання прозорого розчину. Густину отриманої суміши вимірювали за допомогою рефрактометра RE40 (Mettler Toledo, Швейцарія). Кінцевий об'єм фікол-урографінового розчину доводили поступово дистильованою водою до 100 мл, досягаючи величини коефіцієнта заломлення, що дорівнювала 1,074.
Отриману суміш далі використовували для виділення лейкоцитів периферійної крові людини.
Розчин орцинового реактиву. Склад : 100 мг FeCl3Ч6H2O та 100 мг орцину, перекристалізованого з бензолу, розчиняли у 100 мл концентрованої НСІ (с=1,19 г/см3). Реактив зберігали при 4°С не більше 1 місяця.
2.1.5. Культури клітин
Досліди з визначення біологічних властивостей індукторів ІФН, в умовах in vitro, проводили з використанням перещеплюваної лінії клітин тестикул поросят (ПТП), отриманої в НДІ ветеринарії УААН, а також ліній фібробластів мишей L-41 та L-929, отриманих з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України ім. Р.Є. Кавєцького (у якості моделей моношарових клітин). Первинні культури мононуклеарних клітин крові людини І(0) групи, взятої від здорових донорів використовувалися у якості моделі суспензійної культури.
2.1.6. Поживні середовища
Для вирощування і підтримання клітинних культур використовували поживні середовища 199 або Ігла (обидва - виробництва НВП "Біо-Тест-Лабораторія", Україна) у які додавали 5-10% сироватки великої рогатої худоби (НВП "Біо-Тест-Лабораторія", Україна) та, за необхідністю, інші компоненти (див. далі).
2.1.7. Визначення життєздатності клітин
Життєздатність клітин визначали методом виключення барвника живими клітинами при фарбуванні 0,1% розчином трипанового синього в ізотонічному розчині NaCl. Підрахунок пофарбованих і не пофарбованих клітин проводили в гемоцитометрі за стандартною методикою [32].
2.1.8. Вірус-індикатор