Вы здесь

Вміст мелатоніну, ІЛ-8 та ІЛ-10 в плазмі крові хворих на фіброміалгію: зв'язок з клінічними проявами та ефективністю лікування

Автор: 
Коляденко Світлана Вікторівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2007
Артикул:
0407U003515
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
КЛІНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ХВОРИХ.

2.1. Матеріали та методи дослідження
Виходячи з мети та завдань, поставлених в роботі, вона була розділена на три етапи.
На першому етапі у 141 хворих на ФМ та осіб контрольної групи було проведено детальне клініко-біохімічне обстеження з визначенням інтенсивності больового синдрому, втоми, розладів сну, тривалості вранішньої скутості та функціональної здатності, окремих компонентів оксидативного та нітрозативного стресу, показників антиоксидантної системи, рівнів цитокінів, мелатоніну та здійснено кореляційний аналіз між показниками психологічного статусу та біохімічними параметрами обстежених хворих.
На другому етапі у хворих та групи практично здорових осіб було вивчено психологічний статус та когнітивні функції організму та зв'язок їх з рівнем мелатоніну в плазмі крові та співвідношенням ІЛ-8/ІЛ-10.
На третьому етапі у хворих на ФМ проведена фармакотерапія флуоксетином, мелатоніном та поєднанням флуоксетину з мелатоніном.
Інтенсивність больового синдрому, втоми та розладів сну визначали за допомогою візуальної аналогової шкали (ВАШ болю, ВАШ втоми та ВАШ розладів сну). ВАШ оцінювали від 1 до 10 балів, де 1 - відсутність прояву, 10 - максимальна його виразність [243]. Функціональну здатність хворих оцінювали згідно HAQ.
Для оцінки розладів сну використовувалась кількісна шкала, що включає в себе оцінку наступних суб'єктивних симптомів: незадоволеність нічним сном (відповідає скарзі "не виспався"), важкість з засинанням, часті нічні пробудження, неприємні сновидіння, неприємні відчуття під час сну, ранні просинання, збереження втоми після сну, денна сонливість. Частота цих симптомів визначається хворими за 4-х бальною шкалою (0 - "ні", 1 - "іноді", 2 - "часто", 3 - "постійно").
Кількісне визначення карбонільних груп білків проводили за їх здатністю утворювати гідразони з 2,2-динітрофенілгідразином, які поглинають при 270 та 363 нм [16].
Окислювальну (перекисну) модифікації ліпідів плазми крові оцінювали за вмістом диєнових кон'югатів, використовуючи здатність супряжених подвійних зв'язків поглинати при 270 нм [29, 6].
Малоновий діальдегід (МДА) визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою і розраховували за молекулярним коефiцiєнтом екстинцiї 1,56Ч105 [4]. Антиокислювальну активність плазми крові визначали за реакцією з ліпопротеїнами жовтка [18].
Вміст гіалуронової кислоти в плазмі крові визначали за карбазоловою реакцією після її виділення шляхом послідовного хроматографування на тонкому шарі целюлози спочатку в системі етанол-2,5% ацетат кальцію а потім - в системі етанол - 5,0% ацетат кальцію [27].
В сироватці крові визначали вміст метаболітів оксиду азоту - нітритів та нітратів за реакцією з реактивом Гріса - 0,2% на 12% розчині оцтової кислоти [7, 21], після осадження білків ацетонітрилом. Нітрати попередньо відновлювали до нітритів сумішшю цинкового порошку та розчину аміаку [21]. Суму нітратів та нітритів в плазмі крові визначали за спектрофотометричним методом з реактивом Гріса [21].
Вміст вільного токоферолу в плазмі крові визначали після його екстракції та очистки по реакції Емері-Енгеля з бато-фенантролеїном [29]. Вміст ретинолу в сироватці крові визначали за реакцією з трифтороцтовою кислотою [30].
Вміст відновленого глутатіону в сироватці крові визначали з реактивом Елмана за реакцією з 5,5-дитіо-2-нітробензойною кислотою [113].
Активність глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) оцінювали за швидкістю окислення NADPH в глутатіонредуктазній реакції [17].
Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) в еритроцитах визначали за принципом, який грунтується на визначенні кількості відновленого глутатіону, використаного в глутатіонпероксидазній реакції, де в ролі субстрату виступає перекис водню, а джерелом ферменту є гемолізат еритроцитів [12].
Активність супероксиддисмутази (СОД) в гемолізаті крові визначали за реакцією окислення кверцитину [9].
В роботі використані реактиви фірм "Лахема" та "Хемапол" (Чехія), "Реанал" (Угорщина), "Сігма" (США), "Мерк" та "Серва" (Німеччина), а також набори та реактиви вітчизняного виробництва та країн СНД.
Рівень селену в плазмі крові визначали кінетичним методом [15].
Вміст цитокінів в крові - прозапального інтерлейкіну-8 (ІЛ-8) та протизапального інтерлейкіну-10 (ІЛ-10) визначали імуноферментним методом з використанням стандартних наборів фірми "Diaclone"(Франція).
В лунки планшетів, на стінках яких адсорбовані антитіла до відповідних інтерлейкінів, додавали по 100 мкл стандартних розчинів (з відомими концентраціями цитокіну), контрольних проб, проб сироватки крові, а також 50 мкл біотинолових антитіл. Інкубували 60 або 120 хвилин (для визначення ІЛ-8 та ІЛ-10, відповідно) при 18-250С. Лунки відмивали від надлишку незв'язаних реагентів, вносили в них 100 мкл стрептавідин-пероксидази та інкубували упродовж 30 хвилин при 18-250С для утворення на твердій фазі комплексу АТ-АГ-АТ- ензим. Потім лунки знов відмивали від надлишку незв'язаних реагентів і вносили 100 мкл субстратного розчину, який реагує зі зв'язаним на твердій фазі ензимом з утворенням забарвленої речовини, інкубували 15 хв. при 18-250С, реакцію зупиняли 100 мкл стоп-розчину і фотометрували при 450 нм (дифренційний фільтр 630 нм) на автоматичному аналізаторі Stat Fax 303/Plus.
Вміст мелатоніну в сироватці крові - визначали імуноферментним методом з використанням стандартного набору фірми "IBL" (Німеччина).
Після проведення стандартної процедури екстракції (згідно інструкції до набору) в лунки планшетів, на стінках яких адсорбовані антитіла до мелатоніну, додавали по 50 мкл екстрагованих стандартних розчинів (з відомими концентраціями мелатоніну), контрольних проб, проб сироватки крові, а також 50 мкл мелатонін-біотину. Накривали адгезивною плівкою та інкубували 20 годин при 2-80С. Лунки відмивали від надлишку незв'язаних реагентів, вносили в них 150 мкл