РОЗДІЛ 2. МАТЕРИАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Матеріали дослідження
У якості об’єктів дослідження застосовували водні розчини гемоглобіну людини,
отриманого шляхом гемолізу еритроцитів за методом «осмотичного шоку» [81],
розчини комерційних ліофільних електрофоретично-гомогенних препаратів бичачого
метгемоглобіну (М=64.5 кДа) («Fluka», Німеччина), бичачого сироваткового
альбуміну (М=67 кДа) і цитохрому с (М=13.3 кДа, окиснена форма) («Біоритм»,
Україна) призначені для аналітичних досліджень. Водні розчини білків мали
наступні концентрації: гемоглобін – 0.02% (3.1Ч10-6 моль/л), метгемоглобін –
0.02% (3.1Ч10-6 моль/л), альбумін – 0.1% (1.75·10-5 моль/л), цитохром с – 0.05%
(3.75·10-5 моль/л).
2.2. Дизайн експериментальної частини роботи
Експериментальна частина роботи виконувалась на кафедрі біофізики Київського
національного університету імені Тараса Шевченка.
Експериментальна частина складається з чотирьох основних блоків: дослідження
впливу ЗМП на гемоглобін, метгемоглобін, цитохром с і сироватковий альбумін.
Всі експериментальні блоки передбачали вивчення дії ЕМП ННЧ на розчини нативних
білків і білків, що піддавалась дії дестабілізуючих факторів гідрофобної
природи (насичення розчинів бензолом і хлороформом). В експериментах з кожним
білком застосовували єдину схему експозиції - 1, 2, 4 і 24 години. Для всіх
груп зразків проводили дослідження фіктивного впливу ЕМП.
Динаміку структурних змін гемоглобіну, метгемоглобіну, цитохрому с і
сироваткового альбуміну визначали за спектрами поглинання білкових розчинів,
кінетикою процесу ренатурації метгемоглобіну після часткової кислотної
денатурації, здатністю окисненої форми цитохрому с до відновлення, а також
відносній електрофоретичної рухливості сироваткового альбуміну у
поліакриламидном гелі (ПААГ).
Схема експериментальної частини роботи представлена на рисунку 2.1.
2.3. Методи дослідження
2.3.1. Метод впливу змінних магнітних полів на експериментальні зразки
В усіх дослідженнях із впливу імпульсного МП експериментальні зразки поміщали в
пристрій, що являв собою систему з пари кілець Гельмгольця, на які протягом
експерименту подавали змінний електричний струм. Джерелом струму виступав
генератор сигналів спеціальної форми
Г6-28. Індукцію експериментального поля контролювали мікротеслометром
Г-79. Імпульси були прямокутної форми і різної полярності. Частота ЗМП
8 Гц була вибрана на основі раніше встановленої її високої біологічної
проникності, геофізичної значущості і у зв’язку з відносно слабкою
дослідженостю механізму впливу на живі системи. Як відомо, саме ця частота, є
основною резонансною частотою планетарного іоносферного хвилеводу, яка постійно
впливає на живі істоти у біосфері і амплітуда якої суттєво зростає у період
геомагнітних і метеорологічних збурень. Окрім того, у періоди таких збурень
радіочастотне випромінювання природного і техногенного походження, яке
розповсюджується в іоносферному хвилеводі, набуває випадково-модульований
характер з частотами модуляції, що лежать в діапазоні ННЧ [14]. У дослідженнях
частотної залежності реакції сироваткового альбуміну на дію ЗМП застосовували
діапазон ННЧ 0-100 Гц. Індукція ЗМП 25 мкТ була вибрана на основі її
гігієнічної значущості. Дана величина відповідає 25% гранично допустимого рівня
для житлових приміщень і офісів [50] і часто реєструється у дослідженнях
фонових випромінювань побутових приладів, офісної техніки і засобів зв’язку.
Вектор індукції застосованого МП був орієнтованим у напрямку паралельному
вектору ГМП.
Експериментальні зразки розміщували у центральній області кілець Гельмгольця,
де неоднорідність МП не перевищувала 5%. Експозиція складала 1, 2, 4 і 24
години.
Дослідження впливу ЗМП на гемоглобін
Дослідження впливу ЗМП на метгемоглобін
Дослідження впливу ЗМП на цитохром с
Дослідження впливу ЗМП на сироватковий альбумін
Дія ЗМП на розчини гемоглобіну
Дія ЗМП на розчини гемоглобіну, що взаємодіє з бензолом і хлороформом
Дія ЗМП на розчини метгемогло-біну
Дія ЗМП на розчини метгемогло-біну, що взаємодіє з бензолом і хлороформом
Дія ЗМП на розчини .цитохрому с
Дія ЗМП на розчини цитохрому с, що взаємодіє з бензолом і хлороформом
Дія ЗМП на розчини сироватково-го альбуміну
Дія ЗМП на розчини сироваткового альбуміну, що взаємодіє з бензолом і
хлороформом
1-а
годинна дія ЗМП білкових розчинів
Фіктивна дія
2-ох
годинна дія ЗМП білкових розчинів
Фіктивна дія
4-ох годинна дія ЗМП білкових розчинів
Фіктивна дія
24-ох годинна дія ЗМП білкових розчинів
Фіктивна дія
параметри, що реєструвались:
спектри поглинання розчинів гемоглобіну, метгемоглобіну, цитохрому с,
сироваткового альбуміну;
спектри флуоресценції сироваткового альбуміну;
відносна електрофоретична рухливість сироваткового альбуміну в ПААГ;
кінетичні параметри відтворення окисненої форми цитохрому с;
кінетичні параметри лужної ренатурації метгемоглобіну після кислотної
денатурації.
Рис. 2.1. Схема експериментальної частини роботи
У зв’язку з тим, що у залізобетонних конструкціях будівель з щільною
електропроводкою