Ви є тут

Йодпероксидаза та цитокератин № 17 в доопераційній діагностиці папілярного раку щитовидної залози та визначенні резистентності його метастазів до радіойоду

Автор: 
Зелінська Ганна Володимирівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2007
Артикул:
0407U004624
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В роботі використано патогістологічний та пункційний матеріал пацієнтів
чоловічої та жіночої статі, що проходили обстеження та хірургічне лікування в
клініці НДІ ендокринології та обміну речовин АМН України. Вік паціентів
коливался від 8 до 65 років.
Дослідження були проведені на матеріалі 141 злоякісного новоутворення та 86
доброякісних новоутворень щитовидної залози.
Гістохімічні та імуноцитохімічні дослідження проводили на заморожених зрізах
пухлин щитовидної залози, видалених в результаті операцій. Серед них було:
папілярних карцином - 21, фолікулярних раків - 3, вузлових зобів - 11, аденом -
16, кіст - 4, дифузних зобів - 4, фрагментів нормальної тканини, видаленої при
тотальній тиреодектомії - 4.
Цитоморфологічні, цитохімічні та імуноцитохімічні дрослідження проводили на
матеріалі, отриманому в результаті тонкоголкових аспіраційних пункційних
біопсій та на відбитках тканин, отриманих в результаті операції. Серед них - 80
папілярних карцином, 4 фолікулярні карциноми, 3 низькодиференційовані
карциноми, 4 медулярні карциноми, 18 аденом з А-клітин, 33 вузлових зоби, 26
метастазів карцином щитовидної залози.
2.1. Морфологічні методи.
Пунктати, отримані під час проведення тонкоголкових аспіраційних пункційних
біопсій, висушували на повітрі та фіксували на протязі 5 хвилин в метанолі,
після чого висушували та фарбували протягом 30 хвилин сумішшю барвників
Май-Грюнвальда та Романовського-Гімзе. Після фарбування препарати промивали у
дистильованій воді, висушували та досліджували під мікроскопом.
Розчин для фарбування готували із стандартних метанольних концентратів
Шосткінського заводу хімреактивів в такому складі:
Фосфатний буфер 0,07 М з рН 6,5 – 10 мл.
Барвник Май-Грюнвальда (рідкий концентрат) – 0,5 мл.
Барвник Романовського-Гімза (рідкий концентрат) – 1,5 мл.
2.2.Подготовка матеріалу для гістохімічних та імуноцитохімічних досліджень.
Для проведення гістохімічних та імуноцитохімічних досліджень, заморожені зрізи
товщиною 14 мкм виготовляли на кріостаті, висушували та фіксували. Для
проведення імуноцитохімічних реакцій використовували фіксацію метанолом
протягом 5 хвилин. Для виявлення неспецифічної естерази проводили фіксацію в
парах формальдегіду на протязі 2 хвилин. Для визначення активності
йодпероксидази та сукцинатдегідрогенази використовували нефіксовані зрізи. Для
гістохімічного та імуноцитохімічного дослідження матеріалу, отриманого в
результаті тонкоголкових аспіраційних пункційних біопсій новоутворень
щитовидної залози, готували мазки на зразок гематологічних мазків крові та
фіксували або використовували нефіксовані мазки в залежності від вимог методу
визначення тих чи інших речовин.
2.3. Визначення активності ферментів.
Визначення активності сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.99.) проводили на
нефіксованих мазках матеріалу пункційних біопсій, або кріостатних зрізах пухлин
товщиною 14 мкм тетразолієвим методом по Lojda [109]. Реакцію проводили на
протязі 30 хвилин при 37 оС.
Неспецифічну естеразу виявляли на кріостатних зрізах, фіксованих в парах
формальдегіду на протязі 2 хвилин методом азосполучення з нафтолом АS-МХ
ацетатом по Lojda [109]. Реакцію проводили на протязі 45 хвилин при 37 оС.
Для визначення активності йодпероксидази використовували нефіксовані
кріостатні зрізи, відбитки тканин новоутворень щитовидної залози або мазки
матеріалу тонкоголкових пункційних біопсій. Активність ферменту визначали
бензидиновим методом [185].
2.4.Імуноцитохімічні методи.
Імуноцитохімічні реакції проводили непрямим імунопероксидазним методом [186] в
наступній послідовності:
Для пригнічення ендогенної пероксидази зрізи або мазки обробляли 1 % розчином
Н2О2 у PBS (рН 7,2) на протязі 30 хвилин.
Промивали у 3-х змінах PBS.
Наносили на препарат антитіла проти відповідного антигену. При розведенні
антитіл більше, ніж 1:200 з РВS, слід додавати 1 % альбуміну сироватки бика.
Інкубацію проводили на протязі 40 хвилин при 30 оС.
Промивали у 3-х змінах PBS.
Наносили на препарат мічені пероксидазою антитіла проти глобулінів тварини, від
якої отримані перші антитіла. Робоче розведення мічених антитіл робили на РВS з
1 % сироватки людини групи АВ (для зменшення фонового забарвлення). Інкубацію
проводили на протязі 40 хвилин при 30 оС.
Промивали у 3-х змінах PBS.
Проявляли пероксидазну активність у розчині 3,3 діамінобензидину (ДАБ). 1 мг
розчиняли у 6 мл РВS, додавали 10 мкл 6 % Н2О2. Максимальний час проявлення
реакції – 15 хвилин.
Промивали препарати у Н2О2 та при необхідності дофарбовували ядра клітин
гематоксиліном.
Для негативного контролю виключали з обробки п.3, або використовували в ньому
антитіла проти антигену, який не міститься в досліджуваних клітинах. Крім того,
ставили відповідні позитивні контролі.
Для визначення на одному й тому ж зрізі 2 антигенів, проводили подвійну
імунопероксидазну реакцію. Спочатку виявляли перший антиген за описаним вище
методом, місця локалізації якого фарбувались у брунатний колір. Після цього на
тому ж препараті виявляли другий антиген, але на етапі 7 у розчин ДАБ додавали
СоСL2. Місця локалізації другого антигену фарбувались у сіро-блакитний колір.
Для контролю подвійну реакцію проводили у 2-х варіантах, що відрізнялись
послідовністю виявлення антигенів.
Для ідентифікації в тих самих структурах ферментів і антигенів, ії виявлення
проводили на двох послідовних зрізах. Один зріз розміщали на предметному склі,
інший на покривному. Після цього на першому зрізі проводили імуногістохімічні
реакції, а на другому виявляли активність ферменту. Потім зріз на покривному
склі накладали на зріз, р