РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Реактиви
У роботі були використані такі реагенти та матеріали: HEPES, трис - НСl, АДФ,
середовище RPMI 1640, МТТ, нітросиній тетразолій, феназинметасульфат (Sigma,
CША), тритон Х - 100, НАДН (Ferak, ФРН), фосфатидилхолін (БІОЛЕК, Україна),
холестерол (Calbiochem, ФРН), EДTA, EГTA (SERVA, США).
Інші реактиви (сахароза, тіобарбітурова кислота, гептан, диметилсульфоксид,
етиловий спирт, ізопропіловий спирт, дифеніламіновий реактив, ацетальдегід,
трихлороцтова кислота, аскорбінова кислота, сульфат заліза, хлорид кальцію,
ембріональна теляча сироватка та інші) вітчизняного виробництва кваліфікації хч
та охч.
2.2. Виділення клітин різних типів
2.2.1. Ізолювання тимоцитів з тимусу щура
Тимоцити виділяли з тимусу щурів лінії Вістар вагою 120 - 150 г, яких
утримували на стандартному раціоні віварію. Після декапітації тварини проводили
розтин грудної порожнини, вилучали тимус (200 - 300 мг), відділяли його від
сполучної тканини та кровоносних судин і перетирали через чотири шари
нейлонової сітки у буфер А такого складу (мМ): Na2HPO4 - 3, KCl - 5, NaCl -
120, CaCl2 - 1, глюкоза - 10, MgSO4 - 1, NaHCO3 - 4, HEPES - 10, рН 7,4.
Загальний об’єм суспензії доводили до об’єму 10 мл. Клітинну суспензію
відмивали (1000 g, 10 хв) у тому ж буфері, осад ресуспендували до концентрації
2-5·108 кл/мл. Вихід тимоцитів у середньому складав 10·108 кл/г тимусу.
2.2.2. Отримання трансформованих клітин
Трансформовані клітини отримували на 8 - 10 добу після внутрішньо-черевного
перещеплення мишам відповідних штамів клітин від тварин донорів [43]. Кількість
перевитих клітин становила 1·106 на 1 тварину. Клітини асцитної карциноми
Ерліха (рак молочної залози) перевивали безпородним мишам вагою 20 г, яких
утримували на стандартному раціоні віварію Інституту експериментальної
патології, онкології та радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, а
клітини лейкозу L1210 (лімфоїдна лейкемія) - мишам гібридів F1 DBA2.
Клітини асцитної карциноми Ерліха (АКЕ) або лейкозу L1210 відмивали від
асцитної рідини шляхом центрифугування (1000 g, 10 хв) у розчині 0,85% NaCl та
переводили у середовище RPMI 1640. Отримані клітинні суспензії використовували
у подальших експериментах. Вихід пухлинних клітин у середньому складав 7·107
кл/мл суспензії.
Кількість клітин підраховували за допомогою світлового мікроскопу Biolam „ЛОМО”
Р12 у камері Горяєва з використанням 0,4% розчину трипанового синього.
При роботі з тваринами дотримувались Міжнародних принципів Європейської
конвенції про захист хребетних тварин.
2.3. Отримання колоїдних розчинів фулеренів С60 та фулеренвмісних композитів на
основі аеросилу
Метод отримання фулеренів С60 грунтується на випаровуванні графіту, яке
відбувається за умови виникнення електричної дуги з температурою 60000 С після
підведення високої напруги до двох графітових стержнів [139]. Екстракт,
отриманий після обробки продуктів згоряння толуолом, розділяли методом
газорідинної хроматографії. У роботі було використано фулерени С60 із ступенем
очищення 95%. Для отримання колоїдних розчинів органічний розчинник (толуол)
випаровували, до фулеренів С60 додавали дистильовану Н2О та обробляли розчин
ультразвуком (8 Гц, 8 год) [179]. Отриманий темно-коричневий водний розчин
фулеренів С60 (5·10-4 М) є молекулярно-колоїдною системою, яка стабільна
упродовж 12 - 18 місяців при зберіганні в інтервалі температур (4 – 40)0 С.
Фулерени С60 було синтезовано у хімічній лабораторії Технічного університету м.
Ільменау (ФРН) під керівництвом професора Пітера Шарффа.
Для створення С60-композитів використовували сферичні наночастинки (діаметром
10 - 15 нм) діоксиду кремнію (аеросилу А - 300) з прикріпленими до поверхні
амінопропільними ланцюгами з вільним NH2-кінцем (0,9 ммоль/г).
А Б
Рис. 3. Схематичне зображення поверхні С60-композиту-1 (А) та С60-композиту-2
(Б)
С60-композит-1 (С60-амінопропілаеросил) було синтезовано шляхом приєднання
молекул С60 (0,12 ммоль/г) до NH2-кінців амінопропільних ланцюгів (рис. 3 А)
[110]. До складу С60-композиту-2 (С60-антраценальімінопропілаеросил) було
введено антраценаль (С14Н10СОН) (0,2 ммоль/г) шляхом азометинової конденсації
альдегідної групи антраценалю з аміногрупою поверхні (рис. 3 Б). С60-вмісні
композити було надано д.х.н., професором кафедри неорганічної хімії О.А.
Голубом (хімічний факультет Київського національного університету імені Тараса
Шевченка).
Після внесення у середовище інкубації клітин фулеренів С60 та С60-композитів
концентрація у пробі амінопропілаеросилу (АпА) становила 0,02%, С60 – 10-5 М, а
антраценалю – 3•10-4 М.
2.4. Умови постановки експерименту
Інкубацію клітин (2 - 4·106 кл/мл) здійснювали протягом певного терміну у
термостаті при 37оС у середовищі RPMI 1640 з додаванням 8 мМ NaHCO3, 20 мМ
HEPES та 5% ембріональної телячої сироватки. У випадку тривалої інкубації
клітин у середовище інкубації додавали антибіотики – стрептоміцин та пеніцилін
(10 мкг та 10 од на 1 мл середовища відповідно). Клітини інкубували у контролі
та після опромінення без добавок і у присутності фулеренів С60 або
С60-композитів.
Для приготування 10% гомогенату печінки або мозку наважку тканини (1г)
гомогенізували у 9 мл буферу Б (мМ: сахароза – 250, KCl – 50, NaH2PO4 – 2,5,
MgCl2 – 2, НЕРЕS - 10, рН 7,4) у щільно притертому гомогенізаторі Поттера,
білок визначали за методом Лоурі. Гомогенати тканин інкубували без добавок, або
у присутності фулеренів С60 чи С60-композитів.
Для фотозбудження фулеренів С60 проби опромінювали у скляних пробірках ртутною
лампою ДРТ - 1000 потужністю 24 кВт. Фулерени С60 та С60-ком