РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Матеріали
2.1.1. Реактиви та матеріали. В роботі використовували наступні реактиви і
матеріали : PMSF-виробництва фірми “Sigma” (США), 2-меркаптоетанол –“Merk”
(ФРН), додецилсульфат натрію – Sigma” та “Bio-Rad” (США), персульфат амонію –
“Bio-Rad” (США) і “Serva” (ФРН), дитіотрейтол – “Fluka” (Швейцарія),
триоксиметиламінометан – “Sigma” (США), “Serva” (ФРН), “Bio-Rad” (США), “Fluka”
(Швейцарія), акриламід та N,N-метиленбісакриламід – “Bio-Rad” (США) і “Serva”
(ФРН), кумасі блакитний R-250 та кумасі блакитний G-250 –“Bio-Rad” (США) і
“Serva” (ФРН), ДЕАЕ-Сефадекс – “Pharmacia” (Швеція), кумарова кислота люмінол –
Sigma” (США), ЕGTA, EDTA –“Serva” (ФРН), “Fluka” (Швейцарія), ABTS – “Sigma”
(США), TEMED – “Bio-Rad” (США) та “ Ferak” (ФРН), твін-20, тритон X-100 –
“Serva” (ФРН), “Fluka” (Швейцарія), бромфеноловий синій – “Serva” (ФРН),
“Fluka” (Швейцарія), “Bio-Rad” (США) гематоксилін, еозин “Sigma” (США),
3’3’-діамінобензидину тетрагідрохлорид – “Sigma” (США) нітроцелюлозні фільтри –
“ Millipore” (США), “Shl & She” (ФРН), альбумін сироватки бика – “Sigma” (США),
рентгенівська плівка “Оніко” (Україна), “Тасма” (Росія), “Kodak” (США),
кон’югати білок А-пероксидаза , кон’югати антитіл проти імуноглобулінів людини
, миші та кроля – “Sigma” (США), “ДіаПрофМед” (Україна), планшети для
імуноферментного аналізу – Nunk” (Данія), “Sarsted” (ФРН), білкові маркери
молекулярної маси для електрофорезу – Bio-Rad” (США), “Sigma”,(США),
“Pharmacia” (Швеція), малахітовий зелений – Bio-Rad” (США) а також KCl, NaCl,
KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, NaH2PO4, KHCO3, NaHCO3, Na2CO3, K2CO3, NaOH, KOH,
C2H5OH, метол, гідрохінон, гіпосульфіт натрію, борна кислота, лимонна кислота,
желатина, обезжирене сухе молоко, пірофосфат натрію, НСl, H3PO4, трихлороцтова
кислота, оцтова кислота, гліцерин вітчизняного виробництва кваліфікації ч. д.
а., х .ч., ос. ч.
2.1.2. Пацієнти, біоматеріали та лабораторні тварини. Патологоанатомічний
матеріал та сироватки крові хворих дилятаційною та ішемічною кардіоміопатіями
люб’язно надано відділом некоронагенних захворювань міокарда і клінічної
ревматології Інституту кардіології імені М.Д.Стражеско АМН України. Діагноз
ДКМП встановлювали згідно з рекомендаціями Всесвітньої організації охорони
здоров’я (HO/ISFC, 1985) на основі клінічних ознак, інструментальних
(електрокардіограма, рентген, ехокардіограма) та лабораторних досліджень. Групу
ДКМП складали 78 пацієнтів (67 чоловіків і 11 жінок ) віком від 23 до 66 років.
У 37 з них діагностовано ІІ Б, а у 41 – ІІ А стадії хронічної серцевої
недостатності. В групу не брали пацієнтів з фракцією викиду лівого шлуночка
менше 50 %, з вродженими чи набутими клапанними пороками серця, з
онкологічними, інфекційними і ендокринними захворюваннями, а також з ожирінням
вище ІІ ступеня.
Групу ІКМП складали 69 хворих (68 чоловіків і одна жінка) віком від 33 до 70
років, у яких хронічна серцева недостатність розвивалася в результаті
гіпертонічної та ішемічної хвороб серця, 15 з них перенесли інфаркт міокарда. У
дослідження не брали хворих з аневризмою лівого шлуночка серця та хворих з
перенесеним поширеним або трансмуральним інфарктом міокарда. Групи хворих ДКМП
та ІКМП порівнювали за основними критеріями. Як видно з даних наведених у табл.
2.1, відмінності між ними відсутні,
Таблиця 2.1
Клініко-інструментальні показники в групах
Пацієнтів, хворих на ДКМП та ІКМП (М ± м)
Показник
Група
ДКМП
ІКМП
Вік, роки
43,89 ± 1,02
53,26 ± 0,94
0,220
ФК, у. о.
3,08 ± 0,07
2,97 ± 0,08
0,321
ЧСС, в хв.
94,18 ± 2,07
95,90 ± 3,44
0,659
АТ,мм рт.ст.
111,36 ± 1,79
124,77 ± 2,85
0,001
ЛП, мм
47,71 ± 0,73
48,32 ± 1,13
0,642
КСО, мл
189,82 ± 6,48
191,24 ± 9,99
0,904
КДО, мл
290,07 ± 8,13
293,35 ± 11,15
0,816
ФВ, %
34,30 ± 0,86
35,87 ± 1,32
0,345
Примітки:
ФК – функціональний клас по класифікації NYHA; ЧСС – частота серцевих
скорочень; АТ – артеріальний тиск; ЛП – розмір лівого передсердя; КСО –
кінцевий систолічний обўєм; КДО – кінцевий діастолічний об’єм; ФВ –фракція
викиду;
Групу здорових донорів складали 28 донорів Київської станції переливаня крові.
2.1.3. Обладнання. При виконанні цієї роботи використано прилади і обладнання
таких марок та виробників: термостати ТС-80 (Україна), центрифуги К-23, К-24,
К-70 “Janetcky” (НДР) та Spinko L-5, J-2-21 “Beckman” (Австрія),
спектрофотометри Specord та Specoll-11 “Carl Zeis” (НДР), “Titerteck” (Велика
Британія) мікроскопи Біолам-12, ЛОМО, (Росія), Axioplan, “Zeiss” (Німеччина),
рН-метри ЕВ-74 та рН – 121 (Білорусія), ваги ВТ-500 та ВЛТК-500 (Україна),
автоматичні піпетки та дозатори Labsystems” (Фінляндія), ”Gilson” (Франція),
“Plastomed”, (Польща), морозильники “Мінськ 118”, та ”Мінськ 16” (Білорусія),
холодильники “Мінськ 121” (Білорусія), “Норд” (Україна).
2.2. Методи дослідження
2 2.1. Отримання сироваток. Кров інкубували протягом 60 хвилин при температурі
37 0С, центрифугували протягом 15 хвилин при 2000 g і +4 0С. Супернатант
відбирали, додавали рівний об’єм перегнаного гліцерину і зберігали за
температури –20 0С.
2.2.2. Отримання препаратів міозинів. Препарати актоміозину отримували за
методом Margossian [Margossian, 1985]. Всі операції проводили на холоді.
Подріблену наважку міокарда заливали буфером (у співвідношенні 1 : 3), що
містив 30 мМ KCl, 1 мM ЕДТА, 10 мM 2-меркаптоетанолу, 10 мM MgCl2, 10 мM KH
2PO4 (pH-7,0), 1 мM NaN3 та 0,1 мM PMSF. Осад збирали центрифугуванням.
Операцію повторювали двічі. Осад гомогенізували у вище наведеному буфері, який
містив 1 % тритону Х-100. Після центрифугування осад декілька ра
- Київ+380960830922