Розділ 2
матеріали і методи досліджень
2.1. Матеріали, які використовувались в експериментах
В експериментах для стимуляції скорочень гладеньком’язових препаратів
використовували агоніст мускаринових холінорецепторів АCh (“Союзхімреактив”,
Росія). Досліди по вивченню ефекту органічних блокаторів потенціалкерованих
кальцієвих каналів L-типу ГМ здійснювали з використанням ніфедипіну та D600
(Sigma, США). Блокування Na+,K+-АТФази досліджували в присутності оуабаїну
(Sigma, США), а також каліксаренів С99 (біс-гідроксилметилфосфонова кислота),
С107 (каліксаренамінофосфонова кислота) та фрагменту М3
(4-гідроксианіліно-(2-піридил)метил-фосфонової кислоти), що були синтезовані у
відділі хімії фосфоранів в Інституті органічної хімії НАН України під
керівництвом член-кор. НАН України, проф. Кальченка В.І. (рис. 2.1)
.
С99
С107
М3
Рис. 2.1.
Структурні формули штучних інгібіторів натрієвої помпи
2.2. Розчини, які використовувались в експериментах
У роботі використовували наступні розчини:
Фізіологічний розчин Кребса (мМ/л): NaCl - 120,4; KCl - 5,9; NaHCO3 - 15,5;
NaH2PO4 - 1,2; MgCl2 -1,2; CaCl2 - 2,5; глюкоза -11,5 (рН доводили до 7,4
розчином NaOH).
Гіперкалієвий розчин містив К+ у концентрації 80 мМ. Його готували шляхом
заміни у вихідному розчині Кребса необхідної частини іонів натрію на
еквімолярну кількість К+ (рН 7,4).
Номінально безкальцієвий розчин готували аналогічно до розчину Кребса,
еквімолярно замінюючи іони Са іонами Мg (рН 7,4).
Гіпонатрієвий розчин (холіновий і літієвий) готували частковою заміною іонів Na
в омиваючому розчині на іони холін або Li відповідно, таким чином, що
концентрація Na+ становила 25 мМ (для порівняння – в розчині Кребса 137 мМ).
У роботі використовували розчин АCh (10 мкМ), для чого початково готували його
концентрований водний розчин (з розрахунку додавання 1% розчину речовини до
кінцевого об’єму), аліквоту якого вносили в розчин Кребса до одержання
необхідної концентрації.
При використанні оуабаїну, ніфедипіну, D600, каліксаренів С99, С107 та
фрагменту М3 попередньо готували маточний розчин в диметилсульфоксиді (ДМСО) з
розрахунку введення 1% зазначеної речовини в кінцевий об’єм.
2.3. Тензометричні дослідження
Тензометричні досліди проводили на препаратах кільцевих м’язів сліпої кишки
(cаecum) щурів. Самців щурів (маса тварин варіювала в межах 200 – 250 г)
декапітували, вилучали cаecum, промивали розчином Кребса. У ході приготування
препаратів шар м’язів звільняли від слизової оболонки і нарізали на смужки
(середній розмір – 1,5 Ч 10 мм). Усі процедури проводилися при кімнатній
температурі.
Вільні від слизової оболонки кільцеві смужки вміщували в робочу камеру (об’єм 2
мл) з проточним розчином Кребса (швидкість протікання – 5 мл/хв),
термостатовану при 37оС. Препарату надавали пасивний натяг на рівні 10 мН і
залишали на 1 годину (до появи спонтанних скорочень постійної амплітуди і
частоти та скорочень, викликаних АCh і гіперкалієвим розчином, з постійними
механокінетичними параметрами). Експериментальна камера, мала вхідний та
вихідний отвори для руху омиваючого розчину. До порожнини, яка знаходилась під
відсіком камери подавали нагріту воду від рідинного термостату.
Схематичне представлення робочої установки для тензометричних досліджень подано
на рис. 2.2.
Досліджувані речовини в певних концентраціях вносились в розчин Кребса за 30
хвилин до вивчення їх ефекту на скоротливі відповіді препаратів кільцевих
м’язів.
2.4. Метод механокінетичного аналізу повного циклу скорочення-розслаблення
скоротливих відповідей м’язів
Вивчення швидкісних характеристик процесу скорочення-розслаблення м’язових
препаратів здійснювали відповідно до методу Бурдиги Ф.В. та Костеріна С.О.
[11].
Рис. 2.2.
Блок-схема пристрою для дослідження скоротливої активності гладеньком’язових
смужок в ізометричних умовах:
1 - робоча камера, заповнена робочим розчином, з гладеньком’язовим препаратом,
який закріплено на сталевих гачках;
2 – тензометричний датчик;
3 – підсилювач;
4 – електричний потенціометр;
5 – осцилограф;
6 – перистальтичні насоси;
7 – набір робочих розчинів;
8 – термостат.
В основі методу лежить твердження, що хід фази розслаблення викликаних або
спонтанних скорочень різних ГМ звичайно S-подібний і має точку перегину (рис.
2.3). Найпростіший випадок ходу задовольняє такому емпіричному рівнянню:
(2.1)
де:
f – миттєве значення сили, яке відповідає часу t;
fm – величина максимальної сили скорочення, яка досягається в довільний момент
часу t = 0, який обрано як початкову точку фази розслаблення;
ф - характеристичний час фази розслаблення (напів-час розслаблення);
n – коефіцієнт крутизни лінеаризованої фази розслаблення скоротливої
відповіді.
Лінеаризована форма рівняння (2.1) має вигляд:
(2.2)
Метод передбачає лінеаризацію фази розслаблення скоротливих відповідей та спаду
кальцієвого сигналу м’язів в координатах (ln[(fm – f)/f]; ln t) з високим
коефіцієнтом лінійної регресії.
Рис. 2.3. Узагальнена схема циклу скорочення-розслаблення гладенького м’язу, де
fm – амплітуда скорочення, ф - характеристичний час фази розслаблення
(напів-час розслаблення)
З графіків можна отримати декілька транзитних кінетичних показників. Величина
ln ф являє собою відрізок, який відсікає на осі абсцис лінія, проведена через
експериментальні точки, та n – коефіцієнт крутизни, який чисельно визначається
як тангенс кута нахилу лінії:
(2.3)
Ключовим параметром, який дозволяє розрахувати даний метод, – це незалежний від
амплітуди показник нормованої максимальної швидкості фази розслаблення Vn:
(2
- Київ+380960830922