Ви є тут

Роль цистеїнових катепсинів у деградації білків при патологічних станах

Автор: 
Лянна Ольга Леонідівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
0408U000378
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Матеріали
Експериментальну модельну частину роботи проведено на щурах лінії Wistar, 4
місячного віку, вагою 180-220 г (54 тварини). Тварини знаходилися в стандартних
умовах із циклічністю доби: світло – 12 годин, ніч – 12 годин. Для дослідження
використано такі структури та відділи головного мозку: гіпокамп, кора великих
півкуль, мозочок, продовгуватий мозок, таламус/гіпоталамус, а також сироватку
крові. В дослідах використано плазму крові донорів; тканини головного мозку,
без новоутворень, людей, що загинули від нещасного випадку; плазму крові та
післяопераційний матеріал хворих із пухлинами головного мозку (невриноми,
ангіоми, менінгеоми, астроцитоми, гліобластоми); плазму крові та
післяопераційний матеріал хворих із пухлинами щитовидної залози (вузловий
еутиреоїдний зоб, папілярний, фолікулярний рак) (загальна кількість пацієнтів
становила 107 осіб). В процесі виконання дисертаційної роботи було передбачено
заходи по забезпеченню безпеки для здоров’я пацієнтів, дотримання їх прав та
морально-етичних норм у відповідності до конвенції Ради Європи про права людини
і біомедицини, Гельсінської декларації прав людини та відповідних законів
України.
Дослідження проведені з використанням хімічно чистих реагентів: носії для
гель-хроматографії сефадекси G-25, G-50, G-75, G-100, G-150 (“Pharmacia”,
Швеція); носій для іонообмінної хроматографії DEAE- сефадекс A-50 (“Pharmacia”,
Швеція), для афінної хроматографії: конканавалін А-агароза та азоказеїн-агароза
вітчизняного виробництва; блакитний декстран (“Ferak”, Німеччина), сироваточний
альбумін бика (“Sigma”, США), яєчний альбумін, трипсин, рибонуклеаза,
тріомбраст, сечовина, казеїн вітчизняного виробництва, азид натрію (“Sigma”,
США), тритон Х-100 (“Ferak”, Німеччина), в-меркаптоетанол (“Reanal”, Угорщина),
синтетичні субстрати: p-нітроанілід Na-бензоїл-Д,L-аргінін (БАПНА) (“Fluka”,
Швейцарія), 2-нафтіламід L-лейцин (Лей-НА) (“Koch-Light Laboratories”, Англія).
Реактиви для електрофорезу в поліакриламідному гелі. Всі інші реактиви
вітчизняного виробництва класифікації ч.д.а.
2.2. Методи
2.2.1. Визначення активності цистеїнових катепсинів В, L, Н
В ході дослідження проводили аналіз ферментативної активності катепсинів В, L,
Н в усіх об’єктах дослідження. Визначення активності катепсинів виконували
спектрофотометричними методами [64, 230-233], які базуються на тому, що в
процесі ферментативної реакції відбувається відщеплення компонентів –
n-нітроаніліну, в-нафтіламіну та азофарби – від хромогенних субстратів. Поява
цих компонентів в реакційній суміші спричинює забарвлення. В данному випадку
кількість відщеплених компонентів прямо пропорційна активності ферментів.
Активність катепсину В досліджували за розщепленням p-нітроаніліду
Nб-бензоїл-Д,L-аргініну (БАПА) «Fluka» (Швейцарія) за 60 хв інкубації при 37 єС
[64] з деякими модифікаціями [230].
Активність катепсину L визначали за відношенням до 1% азоказеїну,
денатурованому 3М сечовиною за 60 хв інкубації при 37 єС [233]. Азоказеїн
синтезували за методом Сурінова Б.Г. і Манойлова С.Е. [232].
Активність катепсину Н виявляли за гідролізом в-нафтіламіду L-лейцину (Лей-НА)
«Koch-Light Laboratories» (Англія) за 120 хв інкубації при 37 єС [64] з деякими
модифікаціями [230].
Активність ферментів виражали в одиницях активності (ОА) при застосуванні
субстратів: БАПА – в мкмоль p-нітроаніліну (p-НА) за 1 хв; Лей-НА – мкмоль
в-нафтіламіну за 1 хв; азоказеїну – в умовних одиницях абсорбції при 366 нм за
1 хв.
Питому активність (ПА) представляли в ОА на 1 мг білка і визначали в 1,0 мл
інкубаційної суміші з 15 хв преінкубацією ферментів в присутності 0,002 М
в-меркаптоетанолу і 0,001 М Na2ЕДТО.
2.2.2. Виділення та очистка катепсинів В, L, Н
Виділення, очистку та дослідження деяких фізико-хімічних властивостей
катепсинів В, L, Н проводили з тканин головного мозку без новоутворень та
пухлин ЩЗ, згідно до схеми [234].
Гомогенізацію тканин виконували в буфері А, що містив трис-HCl – 0,025 М; рН
7,4; ЕДТО – 0, 001 М; NaCl – 0,15 М; тритон Х-100 – 0,2 % у співвідношенні
тканина:буфер 1:1,2 відповідно. У ході послідовних стадій фракціонування
сульфатом амонію у діапазоні 30-80% насичення та центрифугування (8 000 g Ч 40
хв) були отримані фракції, що містили розчинні та мембранні білки. Осад
ресуспендували в буфері А. Видалення солі з білкових розчинів проводили
діалізом проти 0,15 М NaCl протягом 14 годин, або гель-фільтрацією на колонці з
сефадексом G-25 (“Pharmacia”, Швеція).
Для відокремлення та очищення катепсинів виконували послідовні етапи афінної та
гель-хроматографії.
Зважаючи на високу афінність катепсину Н, через вміст високоманозних
оліговуглеводних залишків, до конканаваліну А, афінну хроматографію проводили
використовуючи конканавалін А-агарозу. Колонку (600 ммЧ100 мм) врівноважували
0,1 М фосфатним буфером Б, що вміщував 0,001 М CaCl2, 0,001 М MgCl2, 0,001 М
MnCl2, 0,5 M NaCl, рН 6,0. Цим буфером вимивали білки, що не зв’язалися з
сорбентом. Елюцію білків, що біоспецифічно зв’язалися з конканаваліном А
проводили буфером Б, що вміщував 10% метил-глюкопіранозид.
Для видалення з білкових фракцій катепсину L використовували афінну
хроматографію на азоказеїн-агарозі, зважаючи на високу афінність ферменту до
азоказеїну. Врівноваження колонки та вимивання білків, що не зв’язалися з
сорбентом проводили 0,1 М фосфатним буфером, що вміщував 1 М NaCl та 0,002 М
b-МЕ, рН 6,0. Для елюції білків, що біоспецифічно зв’язалися з сорбентом
використовували 0,1 М бікарбонатний буфер, що вміщував 1 М NaCl, 0,002 М b-МЕ,
0,001 М ЕДТО, рН 9,0.