РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали
Матеріалом для досліджень були концентрати тромбоцитів (КТ), отримані
фракціонуванням цільної донорської крові, заготовленої на консерванті
“Глюгіцир”. Донорами були чоловіки молодого та середнього віку з групою крові А
(ІІ). Забір крові здійснювали у подвоєні та потроєні полімерні контейнери
“Гемакон 500/300” та “Гемакон 500/300/300”. У разі необхідності отримання
закритої трьохконтейнерної (при вилученні КТ із збагаченої тромбоцитами плазми)
або чотирьохконтейнерної системи (при вилученні КТ з лейко-тромбоцитарного
шару) вищезазначені контейнери з’єднували з контейнерами “Компопласт 300” або
“Компопласт 300/300”.
2.2. Методи виділення КТ
Виділення КТ здійснювали в перші чотири години після забору крові за допомогою
рефрижераторної центрифуги ЦРЛ 05-01 при температурі 22 ± 2 єC. Для
попередження затримки формених елементів у складках контейнерів, що утворюються
при осіданні останніх під час центрифугування, контейнери з кров’ю або
збагаченою тромбоцитами плазмою фіксували між двома металічними пластинами. Цей
захід сприяв зменшенню домішку залишкових клітин у КТ та втрат тромбоцитів при
видаленні плазми.
2.2.1. Виділення КТ із збагаченої тромбоцитами плазми (КТ із ЗТП) [12]
Схема виділення КТ із ЗТП представлена на рис. 2.1.
I етап – центрифугування крові при 680g протягом 13 хвилин, переведення
одержаної ЗТП за допомогою плазмоекстрактора в сателітовий пустий контейнер
(2), від’єднання контейнера (1) з еритромасою;
II етап – центрифугування ЗТП при 2400g протягом 20 хвилин, видалення надлишку
бідної на тромбоцити плазми (БТП) у контейнер (3) таким чином, щоб у контейнері
(2) з осадом тромбоцитів залишилося 55 ± 5 мл плазми, від’єднання контейнера
(3), ресуспендування тромбоцитів у плазмі обережним розтиранням осаду через 1 –
1,5 години після центрифугування (часу, необхідного для дезагрегації
тромбоцитів).
Рис. 2.1. Схема виділення КТ із ЗТП
2.2.2. Виділення КТ з лейко-тромбоцитарного шару (КТ з ЛТШ) [1]
Схема виділення КТ з ЛТШ представлена на рис. 2.2.
I етап – центрифугування крові при 2130g протягом 20 хвилин, переведення
надлишку БТП в сателітовий пустий контейнер (2) таким чином, щоб над утвореним
ЛТШ залишилося 55 ± 5 мл плазми, від’єднання контейнера (2), переведення ЛТШ
разом із залишком плазми і верхнім шаром (50 ± 10 мл) еритроцитів в контейнер
(4), від’єднання контейнера (1);
II етап – центрифугування вмісту контейнера (4) при 180g протягом 12 хвилин,
переведення КТ з контейнера (4) в контейнер (3), від’єднання контейнера (4) з
осадом еритроцитів і лейкоцитів.
Рис. 2.2. Схема виділення КТ з ЛТШ
2.3. Методологічна послідовність проведення досліджень структурної цілісності
та функціональних властивостей тромбоцитів на етапах, що передують
кріоконсервуванню
Схема проведення досліджень на етапах, що передують кріоконсервуванню,
представлена на рис. 2.3.
Перед проведенням експериментальних досліджень КТ зберігали у контейнерах
“Компопласт” до 18 – 24 годин при температурі 22 ± 2 єC, в режимі постійного
перемішування на автоматичній мішалці (ІПКіК НАНУ) зі швидкістю 2 об/хв.
Оцінку якості КТ проводили у межах 2 – 4 годин та через 18 – 24 години після
виділення. Визначали кількісний склад КТ (концентрацію тромбоцитів і залишкових
клітин: еритроцитів, лейкоцитів) та морфофункціональні властивості тромбоцитів:
здатність накопичувати флуорохром акридиновий оранжевий (АО); здатність до
індукованої АДФ та колагеном агрегації, реакцію на гіпотонічний шок (РГШ).
Ступінь пошкодження кров’яних пластинок визначали за активністю ферменту
лактатдегідрогенази (ЛДГ) в супернатанті після центрифугування суспензії (КТ
або ЗТП) при 1200g (3000об/хв) протягом 15хв.
У роботі використовували кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, ГЛ, ОЕГn=5,
очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. Розчини
кріопротекторів готували ex tempore.
З метою мінімізації осмотичного стресу додавання розчинів кріопротекторів:
ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД до КТ у співвідношенні 1:1 здійснювали у відповідності до
рекомендованих схем [19,65,217] при температурі 22 ± 2 єC.
При дослідженні здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних
радикалів в модельній системі кінцеві концентрації водних розчинів кріозахисних
сполук складали: 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125; 0,0625 мг/мл.
При дослідженні впливу кріопротекторів на інтенсивність ПОЛ у системі
“тромбоцити-плазма” на етапі експозиції застосовували розчини кріопротекторів
на плазмі у концентраціях, близьких до тих, що застосовуються при
кріоконсервуванні тромбоцитів. Визначення у системі вмісту ГПЛ здійснювали
після експозиції КТ в 0,5; 0,7 та 1 М розчинах кріопротекторів (ОЕГn=5: 0,25 та
0,125 М) протягом 5; 15; 30 хвилин. Інтенсивність індукованого іонами заліза
ПОЛ визначали в системі “тромбоцити-плазма” за присутності 0,7 М
кріопротекторів (ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М) одразу після введення індуктора,
через 15 і 30 хвилин.
При дослідженні впливу кріопротекторів на морфофункціональні властивості
тромбоцитів на етапі експозиції при 22 ± 2 °C були використані розчини ДМСО,
1,2-ПД та ДМАЦ на плазмі:
Цитологічне дослідження проводили після 5-хвилинної експозиції КТ в 0,7 і 1,4 М
розчинах кріопротекторів та видалення останніх.
Агрегаційну здатність тромбоцитів визначали:
в присутності 0,1 М розчинів кріопротекторів (одержані показники виражали у
відсотках до показників агрегації тромбоцитів зразка, у який замість розчину
кріопротектора вводили плазму (контроль А));
після 5- або 30-хвилиної експозиції КТ в 0,7 і 1,4 М розчинах кріопротекторів
та видалення останніх (результати виражали у від
- Київ+380960830922