РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт і схема досліджень
Дослідження проводились на самцях щурів лінії Вістар, які утримувались на
стандартному раціоні. В процесі роботи використано 500 тварин.
Досліди проведено на щурах трьох вікових груп:
* 3-місячного віку (період статевого дозрівання; молоді);
* 6-місячного віку (період статевої зрілості; дорослі);
* 18-місячного віку (період старості; старі) [155].
Отруєння кадмію сульфатом (у подальшому кадмій) проводилося шляхом щоденного
внутрішньочеревного введення кадмію сульфату в 0,89 % розчині натрію хлориду, з
розрахунку 0,134 мг/100 г маси тіла тварини, що становить 1/50 LD50 [29, 155].
Інтактним тваринам внутрішньочеревно вводився відповідний об’єм 0,89 % розчину
натрію хлориду.
Дослід тривав 14 діб.
Тварин декапітували під ефірним наркозом на 15 добу від початку досліду.
Дослідні тварини були поділені на 2 групи:
* І – інтактні щури;
* ІІ – щури, яким уводили кадмію сульфат (у подальшому щури, отруєні кадмію
сульфатом).
Проведено 3 серії дослідів. Першу серію проведено на щурах 3-місячного віку;
другу – на щурах 6-місячного віку; третю – на щурах 18-місячного віку.
2.2. Матеріали, методи і методики досліджень
2.2.1. Матеріали досліджень
Матеріалом для дослідження слугували кров і внутрішні органи: печінка, нирки,
селезінка, легені, серце.
Визначали якісні і кількісні характеристики вільних амінокислот у крові та
внутрішніх органах, а також концентрацію показників азотного обміну та вміст
метаболітів циклу трикарбонових кислот і гліколізу – в крові та печінці щурів
усіх досліджуваних груп.
Для дослідження якісних і кількісних характеристик вільних амінокислот брали
зразки крові, печінки, нирок, селезінки, легенів, серця інтактних щурів і
щурів, отруєних кадмію сульфатом, трьох вікових груп.
Визначення концентрації показників азотного обміну – аміаку, креатиніну,
сечовини і загального білка проводилися у крові інтактних щурів і щурів,
отруєних кадмію сульфатом, трьох вікових груп.
Дослідження вмісту метаболітів гліколізу – лактату, пірувату, циклу
трикарбонових кислот – оксалоацетату, малату, б-кетоглутарату проводили у
печінці та крові інтактних щурів і щурів, отруєних кадмію сульфатом, трьох
вікових груп.
2.2.2. Методи і методики досліджень
2.2.2.1. Визначення концентрації сечовини, креатиніну, аміаку, загального білка
та глюкози у крові
Концентрацію глюкози, сечовини, загального білка та креатиніну у крові
визначали за допомогою біохімічного аналізатора Microlab – 200 (Нідерланди).
Дослідження проводилися згідно з методиками, визначеними інструкцією, з
використанням стандартних наборів реагентів фірми «Human» (Україна).
Визначення концентрації сечовини в крові
Матеріал для зразка: сироватка крові.
Принцип методу: сечовина гідролізується уреазою до амонію та двоокису карбону.
В присутності гіпохлориту та саліцилату, амоній дає зелене забарвлення
(модифікована реакція Бертло). Поглинання при довжині хвилі Hg 578 нм
пропорційно концентрації сечовини в зразку.
Реагенти:
Реагент 1
Фосфатний буфер (рН 7,0) 120 ммоль/л
Натрію саліцилат 60 ммоль/л
Натрію нітропрусид 5 ммоль/л
ЕДТА 1 ммоль/л
Реагент 2
Фосфатний буфер (рН < 13,0) 120 ммоль/л
Натрію гіпохлорит 0,6 г/л
Реагент 3 (ферментний концентрат)
Уреаза > 500 кОд/л
Реагент 4 (стандарт сечовини)
Сечовина 80 мг/дл (13,3 ммоль/л)
Натрію азид 0,095 %
В першу пробірку вноситься 500 мкл реагенту та 5 мкл стандарту.
В другу пробірку вноситься 500 мкл чистого реагенту.
В третю пробірку вноситься 500 мкл реагенту та 5 мкл проби.
Змішування розчинів проводиться безпосередньо перед початком проведення
вимірювання.
Визначення концентрації креатиніну в крові
Матеріал для зразка: сироватка крові.
Принцип методу: креатинін у лужному середовищі реагує з пікриновою кислотою,
утворюючи комплекс Яновського (рожево-червоного кольору). Абсорбція утвореного
кольорового забарвлення прямо пропорційна концентрації креатиніну в зразку.
Поглинання при довжині хвилі Hg 492 нм пропорційно концентрації сечовини в
зразку.
Принцип реакції:
Реагенти:
Реагент 1
Пікринова кислота 26 ммоль/л
Реагент 2
Натрію гідроксид 1,6 моль/л
Реагент 3 (стандарт креатиніну)
Креатинін 2 мг/дл (176,8 мкмоль/л)
В першу пробірку вноситься 500 мкл реагенту та 50 мкл стандарту.
В другу пробірку вноситься 500 мкл реагенту та 50 мкл стандарту.
Змішування розчинів проводиться безпосередньо перед початком проведення
вимірювання.
Визначення концентрації загального білка в крові
Матеріал для зразка: сироватка крові.
Принцип методу: в лужному середовищі іони купруму взаємодіють з білками,
утворюючи фіолетовий комплекс. Поглинання цього комплексу при довжині хвилі Hg
546 нм пропорційне концентрації білка в зразку.
Реагенти:
Реагент 1
Натрію гідрокисд 200 ммоль/л
Калій-натрій виннокислий 32 ммоль/л
Купруму сульфат 18 ммоль/л
Калію йодид 30 ммоль/л
Реагент 2 (стандарт білка)
Білок 8 г/дл (80 г/л)
Натрію азид 0,095 %
В першу пробірку вноситься 500 мкл реагенту 1.
В другу пробірку вноситься 500 мкл чистого реагенту 1 і 10 мкл реагенту 2.
В третю пробірку вноситься 500 мкл реагенту 1 та 10 мкл проби.
Вміст кожної пробірки ретельно перемішується, проводиться інкубація впродовж 10
хв при кімнатній температурі, після чого проводиться визначення вмісту глюкози
в зразку.
Визначення концентрації глюкози в крові
Матеріал для зразка: сироватка крові.
Принцип методу: в процесі окиснення глюкози глюкозоксидазою утворюється
гідрогену пероксид, який взаємодіє з фенолом і 4-амінофеназоном (в присутності
пероксидази), утворюючи червоно-фіолетовий хінонимін, за кількостю якого
визначають кіл
- Київ+380960830922