Ви є тут

Стереологічне дослідження впливу хронічної епізодичної гіпоксії на розвиток деяких відділів головного мозку у експерименті.

Автор: 
Тадтаєв Сергій Георгійович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2008
Артикул:
0408U001097
129 грн
Додати в кошик

Вміст

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Экспериментальная модель
Данное исследование было проведено в сотрудничестве с институтом медицинских исследований Northwick Park (Лондон, Великобритания) и научно-исследовательским институтом при детской больнице Kosair (Луисвилль, США), причем, экспериментальные процедуры на животных проводились в институте Kosair, а гистологическая и морфометрическая обработка экспериментального материала - в институте Northwick Park.
2.2. Экспериментальные животные
В экспериментальных процедурах использовалось потомство крыс линии Sprague-Dawley, которые были приобретены у коммерческого производителя Charles River Laboratories (Wilmington, США). Экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения США [176]. Все усилия были направлены на уменьшение дискомфорта, причиненного животным и уменьшение количества задействованных животных.
2.3. Экспериментальный аппарат
Экспериментальные животные подвергались воздействию эпизодической гипоксии с помощью аппарата Oxycycler модели А44ХО (Reming Bioinstruments, Нью Йорк, США) (см. рис. 2.1). Аппарат состоял из четырех идентичных камер размерами 75x50x50 см, каждая из которых вмещала шесть крыс (по три животных в каждой клетке). Эксперимент проходил в 12-часовом световом режиме (с 6.00 до 18.00) и при комнатной температуре 22-24оС.

Рис. 2.1. Экспериментальный аппарат Oxycycler и камеры с клетками для животных
Газовая смесь циркулировала через камеры со скоростью 60 л/мин (одна полная смена за 10 секунд). Концентрация кислорода постоянно измерялась газовым анализатором и контроллировалась с помощью компьютеризированной системы, которая управляла соленоидными газовыми клапанами таким образом, что заданная концентрация кислорода устанавливалась и поддерживалась автоматически. Отклонения от заданного состава газовой смеси корректировались автоматически добавкой N2 или O2.
Концентрация CO2 в камерах периодически и автоматически измерялась и поддерживалась на уровне 0,01 %, путем регуляции общего газообмена. Аммиак удалялся из газовой смеси путем циркуляции через молекулярное решето (Тип 3A, Fisons, Великобритания), а влажность поддерживалась на уровне 50 % с помощью циркуляции газовой смеси через морозильную камеру и кремнегель. Профиль эпизодической гипоксии задавался путем замены комнатного воздуха в камерах на газовую смесь содержащую 10 % O2 каждые 90 секунд 24 часа в сутки.
2.4. Экспериментальная процедура
После родов приплоды были уменьшены до 8 крысят с целью обеспечения одинаковых условий вскармливания и содержались в виварии при атмосферной концентрации O2 до начала экспериментальных процедур на десятый день после родов (П10). Со дня П10 до дня П25 крысята вместе с самками размещались в камерах экспериментального аппарата и подвергались воздействию эпизодической гипоксии. Самки-матери удалялись из клеток, после того как крысята переходили на самостоятельное вскармливание. Животные контрольной группы находились в соседних камерах в условиях циркулирующего комнатного воздуха. Одна треть животных экспериментальной и контрольной групп была выведена из эксперимента с использованием перфузионной фиксации в возрасте четырех, восьми и двадцати недель.
В целом, в этом исследовании было задействовано 48 крыс обоего пола: 24 - в группе контроля и 24 в экспериментальной группе:
Экспериментальные группы:
* 4 недели ЭГ (n=8), 4 самца и 4 самки возрастом 4 недели
* 8 недель ЭГ (n=8), 4 самца и 4 самки возрастом 8 недель
* 20 недель ЭГ (n=8), 4 самца и 4 самки возрастом 20 недель
Контрольные группы:
* 4 недели КВ (n=8), 4 самца и 4 самки возрастом 4 недели
* 8 недель КВ (n=8), 4 самца и 4 самки возрастом 8 недель
* 20 недель КВ (n=8), 4 самца и 4 самки возрастом 20 недель
2.5. Перфузионная фиксация
Непосредственно перед терминальной процедурой крысы были анестезированы интраперитонеальной инъекцией пентобарбитала (50 мг/кг). Кожа разрезалась вдоль грудины для обнажения ребер, после чего грудная полость открывалась путем разрезания ребер ножницами и отгибания грудины (см. рис. 2.3). Обнаженный перикард рассекался ножницами и игла (18 размер) вводилась в левый желудочек и восходящую аорту, а в стенке правого желудочка делался разрез.
Перфузия начиналась фосфатно-буферизированным солевым раствором (phosphate-buffered saline (PBS) объемом около 400 мл со скоростью 40 мл/мин при комнатной температуре. После того, как солевой раствор, покидающий правый желудочек, переставал быть окрашенным кровью, производилось переключение на 4 % нейтральный раствор формальдегида (400 мл со скоростью 40 мл/мин при комнатной температуре). Судорожное подергивание тела крысы считалось начальным знаком эффективной перфузии, а обесцвечивание и затвердение тканей указывало на завершение процедуры.
После завершения перфузии скальп крысы рассекался скальпелем, позвоночник отсекался от черепа на уровне foramen magnum, , после чего череп разрезался от foramen magnum до уровня обонятельных луковиц. Мозг аккуратно извлекался из черепа и помещался в 4 % нейтральный раствор формальдегида для дополнительно иммерсионной фиксации при температуре 4оС.
2.6. Гистологическая обработка экспериментального материала
2.6.1. Подготовка гистологического материала
По завершении фиксации в растворе формалина мозг экспериментальных животных взвешивался на лабораторных весах, после чего разделялся на несколько частей в соответствии с требованиями морфометрических стереологических методов. Несмотря на то, что стереотаксическая система не была использована для произведения диссекции, приблизительные стереотаксические координаты разрезов даны в отношении к брегме, т.е. краниометрической точке, соответствующей месту соединения сагиттального и венечного швов на поверхности черепа, в соотвествии с атласами головного мозга крысы [166,177]. Разрезы производилась скальпелем под диссекционным микроскопом Wild Heerb