РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы исследований
Материалом для исследований служили эритроциты практически здоровых людей-доноров (40 человек), а также больных желчнокаменной болезнью (35 человек) и циррозом печени (30 человек) в возрасте от 45 до 50 лет. Кровь доноров получали на станции переливания крови г. Симферополя, кровь больных - на базе 7-й городской больницы и хирургического отделения Республиканской больницы им. Н. Семашко (г. Симферополь).
Взятие крови проводили по медицинским показаниям, диагнозы были установлены врачами хирургического и гастроэнтерологического отделений соответствующих больниц г. Симферополя. Кровь брали, используя в качестве антикоагулянта гепарин.
Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и трижды промывали охлажденным физиологическим раствором.
2.2. Постановка экспериментов по изучению непосредственного воздействия активных форм кислорода на эритроциты доноров
В целях изучения реакции эритроцитарных клеток на непосредственное воздействие активных форм кислорода отделенные от плазмы эритроциты доноров помещали (в соотношении 1:1) в среду Фентона, содержащую 10 mM FeSO4?7H2O и 3 mM H2O2 и генерирующую АФК [61].Среду Фентона готовили на физрастворе, во все образцы эритромассы вносили консервант - 2 % двузамещенный цитрат натрия.
Эритроциты инкубировали в этих условиях в течение 2-х, 4-х и 24-х часов при 37?С. Использовали стерилизованные стеклянные пробирки и пипетки (выдерживали в печи Пастера при 170?С в течение 1 часа, предварительно закрыв ватными пробками и завернув в фильтровальную бумагу).
После инкубации в среде Фентона эритроциты отделяли центрифугированием (3000 об/мин, 15 мин) и подвергали гемолизу равным объемом дистиллированной воды [236].
2.3. Методы исследований
2.3.1. Препаративное выделение главной электрофоретической фракции гемоглобина и проверка её гомогенности
Главную электрофоретическую фракцию гемоглобина (HbA) выделяли с помощью препаративного электрофореза в блоках 7-% ПААГ, используя специально изготовленные камеры [2]. В каждую камеру вносили по 1 мг гемолизата эритроцитов.
Электрофорез проводили в трис-глицериновом буфере с рН 8,3 при напряжении 50 В и силе тока 10 мА на один блок геля (1?10?10 см) в течение 5-6 часов в холодильнике. Выделенную фракцию гемоглобина проверяли на чистоту аналитическим электрофорезом в 7 % ПААГ [231], диализировали против дистиллированной воды (в течение 2-х суток в холодильнике) и лиофилизировали.
2.3.2. Определение полимерных форм гемоглобина методом гель-хроматографии в тонком слое сефадекса
Гель-хроматографию гемоглобина проводили в тонком слое сефадекса Г-75 "Superfine" (из расчета 1,8 г сефадекса на пластину размером 20?20 см) [174]. Перед нанесением на стеклянные пластины сефадекс помещали в 0,2 М фосфатный буфер рН 7,0 для набухания в течение 3-х суток.
Пластины с нанесенным гелем устанавливали в специально изготовленную на кафедре камере, и затем на гель, в намеченные заранее точки, вносили по 5 мкл 1 %-ного раствора исследуемых белков и белков-стандартов. В качестве стандартных белков использовали ?-глобулин человека, гемоглобин человека ("Reanal", Венгрия), ?-химотрипсин и трипсин крупного рогатого скота (фирмы "Spofa", Чехия) и кристаллический яичный лизоцим.
Продолжительность опыта составляла 6 часов при средней скорости миграции белков 1 см/час и температуре 20-22?С. По окончании фильтрации с помощью хроматографической бумаги получали реплики гелевых пластин, которые высушивали и окрашивали 0,5 %-ным раствором бромфенолового синего.
Затем, определив путь, пройденный каждым белком (R, см) и построив график зависимости между логарифмом молекулярной массы белков-стандартов и коэффициентом миграции (1/R), рассчитывали молекулярную массу исследуемых образцов гемоглобина (рис. 2.1).
Возможность полимеризации гемоглобина оценивали по количеству фракций белка и их молекулярной массе.
1 - яичный лизоцим;
2 - трипсин;
3 - гемоглобин;
4 - сывороточный альбумин;
5 - гамма-глобулин.
Рис. 2.1. График зависимости коэффициента миграции (1/R) стандартных белков от логарифма их молекулярной массы
2.3.3. Количественное определение гемоглобина в гемолизатах эритроцитов
Концентрацию гемоглобина в гемолизатах определяли унифицированным гемиглобинцианидным методом, применяемым в практике клинической биохимии.
Принцип метода. Гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.
К 5,0 мл трансформирующего раствора (ацетонциангидрин) приливали 0,02 мл гемолизата и хорошо перемешивали. Через 10 мин измеряли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре КФК-2 при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы трансформирующего раствора.
Стандартные растворы гемиглобинцианида ("Reanal", Венгрия) измеряли при тех же условиях, что и опытные пробы. Концентрация гемиглобинцианида в исходном стандартном растворе составляла 59,75 мг %, что соответствует концентрации гемоглобина в крови 152 % при его разведении в 251 раз.
Расчет содержания гемоглобина в г/л производили по калибровочному графику.
2.3.4. Определение содержания метгемоглобина
Определение количественного содержания метгемоглобина в исследуемых растворах белка осуществляли цианметгемоглобиновым методом [125]. К 0,08 мл гемолизата добавляли 3,92 мл фосфатного буфера (рН 6,8), перемешивали и спектрофотометрировали при 630 нм на спектрофотометре СФ-16 (величина экстинкции Е1630). Для перевода метгемоглобина в цианметгемоглобин в кювету добавляли каплю ацетонциангидрина, перемешивали и через 3 минуты вновь спектрофотометрировали при той же длине волны (величина экстинкции Е2630).
В кювету вносили 3-4 кристалла K3Fe(CN)6 для перевода всего кровяного пигмента в циан