РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Розчини, що було використано в роботі
LB: 0,01% NaCl, 0,01% триптон, 0,005% дріжджовий екстракт
PBS: 1,7 мМ KH2PO4, 5,2 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl
2хBBS: 50 мМ BES (N,N-біс(2-гідроксиетил)-2-аміноетансульфонова кислота), 280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HPO4 pH 6,95
TBS: 10 мM Трис-HCl pH 8,0 (2-аміно-2(гідроксиметил)-1,3-пропандіол), 150 мM NaCl
F+: середовище DMEM, 10% FCS (фетальна бичача сироватка), 1% піруват натрію, 1% розчин амінокислот (Sigma, США)
C+: середовище DMEM, 10% CS (бичача сироватка), 1% піруват натрію, 1% розчин амінокислот (Sigma, США)
Л1: 50 мM NaH2PO4, 300 мM NaCl, 10 мM імідазол, 1 мМ PMSF (фенілметилсульфоніл флуорид), 1% апротинін, 1% Тритон X-100, pH 8,0
Л2: 150 мM NaCl, 50 мM Трис-HCl pH 7,5, 1% Тритон X-100, 1% апротинін
Л3: 50 мM Трис-HCl pH 7,5, 1% Тритон X-100, 150 мM NaCl, 5 мM MgCl2, 1 мM DTT, 1 мM PMSF, 1% апротинін
Л4: 50 мM Трис-HCl pH 7,5, 1% Тритон X-100, 500 мM NaCl, 10 мM MgCl2, 1 мM PMSF, 1% апротинін
Л5: 20 мM Трис-HCl pH 7,5, 1% Тритон X-100, 100 мM NaCl, 0,5 мM EDTA (етилендинітротетраоцтова кислота), 1 мM PMSF, 1% апротинін
В1: 50 мM NaH2PO4, 300 мM NaCl, 20 мM імідазол, 1 мM PMSF, 1% апротинін, 1% Тритон X-100, pH 8,0
B2: 50 мM Трис-HCl pH 7,5, 0.5% Тритон X-100, 150 мM NaCl, 5 мM MgCl2, 1 мM DTT, 1 мM PMSF, 1% апротинін
B3: 50 мM Трис-HCl pH 7,5, 1% Тритон X-100, 150 мM NaCl, 10 мM MgCl2, 1 мM PMSF, 1% апротинін
Е1: 50 мM NaH2PO4, 300 мM NaCl, 250 мM імідазол, 1 мM PMSF, 1% апротинін, 1% Тритон X-100, pH 8,0
Е2: 8 M мочевина, 1% CHAPS (3-[(3-хлорамідопропіл)диметиламоніо]-1-пропансульфонат), 0,4% DTT (1,4-димеркапто-2,3-бутандіол), 0,5% буфер IPG pH3-10 (GE Healthcare, Швеція)
Е3: 8 мМ мочевина, 100 мM NaH2PO4, 300 мM NaCl, 10 мM Трис-HCl pH 4,5
І1: 0,1% Твін-20, 3% БСА вільного від жирних кислот у розчині TBS
І2: 0.1% Тритон X-100, 5% БСА в розчині PBS
Ф1: 10 мM Трис-HCl pH 6,8, 0,1% бромфенол синій, 10% гліцерин, 2% SDS, 200мМ 2-?-меркаптоетанол
Ф2: 25 мM Трис, 250 мM гліцин pH 8,3, 0,1%SDS
Ф3: 0.25% Кумасі синій, 45% метанол, 10% оцтова кислота
Ф4: 45% метанол, 10% оцтова кислота
Д1: 10% оцтова кислота, 20% метанол
Д2: 30% етанол, 0,125% глютардіальдегід, 0,2% тіосульфат натрію, 0,8 М ацетат натрію
Д3: 0,25% AgNO3, 0,015% формальдегід
Д4: 0,2 мМ Na2CO3, 0,015% формальдегід
Т1: 25 мM Трис, 250 мM гліцин pH 8,3, 20% метанол
А1: 20 мM Трис-HCl pH 8,0, 100 мM NaCl, 2 мM EDTA, 0,2 мM DTT
A2: 20 мM Трис-HCl pH 8,0, 100 мM NaCl, 10 мM MgCl2, 0,5 мг/мл БСА
А3: 20 мM Трис-HCl pH 8,0, 100 мM NaCl, 10 мM MgCl2
2.2. Ферменти, що були використані в роботі
Pfu-Turbo(r) полімераза (Stratagene, США), ендонуклеази рестрикції HindIII, PstI, BamHI, SmaI, BclI, EcoRI, HincII -New England Biolabs, Велика Британія; лігаза T4 DNA Ligase -Fermentas, Литва.
2.3. Антитіла і барвники, які були використані в роботі
Вестерн-блот аналіз. Моноклональні мишачі анти-6xhis антитіла (mouse IgG2a, 0,5 мг/мл в PBS) виробництва Clontech, США; анти-myc (myc.A7, 100 мкг/мл), анти-HA (12CA5, 100 мкг/мл), анти-Flag (F-tag-01, 100 мкг/мл), анти-тубулін (АА12, 200 мкг/мл), анти-SMC1 (5911G5, 200 мкг/мл), анти-Cdc42 (B-8, 200 мкг/мл), анти-RhoA (26C4, 200 мкг/мл) виробництва Santa Cruz Biotechnology, США; поліклональні кролячі: анти-GFP (antiGFP, 2 мг/мл) виробництва MolecularProbes, США, анти-Rac1 (C-11, 200 мкг/мл), анти-Abl антитіла (С-19, 200 мг/мл) виробництва Santa Cruz Biotechnology, США; вторинні моноклональні анти-мишачі, анти-кролячі антитіла, кон'юговані з пероксидазою хрону виробництва Amersham Bioscienses, США.
Флуоресцентна мікроскопія. Анти-мишачі TRITC (тетраметилродамін В ізотіоцианат) -кон'юговані (1 мг/мл, SouthernBiotech, Швеція), анти-кролячі Cy2(tm)-кон'юговані антитіла ( 1,5 мг/мл, Jackson ImmunoResearch, США), моноклональні мишачі анти-GM130 (Н-7, 200 мкг/мл, Santa Cruz Bitechnology, США); фалоїдин TRITC -кон'югований, DAPI (2-(4-амідинофеніл)-6-індолкарбомідин дигідрохлорид) виробництва Sigma, США.
2.4. Бактеріальні штами, вектори, культури клітин ссавців
Лінії клітин E.coli: XL1-Blue з генотипом: endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq ?(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+); DH5?
з генотипом F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG ?80dlacZ?M15 ?(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), ?- виробництва Stratagene, США; BL21(DE3) з генотипом F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) ?(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) виробництва Novagen, США.
Плазмідні вектори: pET32a (Novagen, UAS), pUC19 (NEB, Велика Британія), pEGFP-C1 (Clontech, США), pRK5-myc зроблений на основі вектора pRK5 (Farmingen, Швеція) отримано від P.Aspenstrom (LICR, Швеція). Вектор pCMV, що експресує PLC? з flag послідовністю, було отримано від др. Josephs M. (Лондон, Велика Британія) [86]. Конструкцію, на основі вектора pEF4, що експресує зизимін1 з епітопом НА, було отримано від др. Meller N. (Університет Вірджинії, США) [87]. Конструкції з p190 Bcr-Abl на основі вектора pSG5 і з р210 Bcr-Abl на основі вектора pCDE було отримано від др. Heisterkamp N. (Дитячий госпіталь Лос-Анджелесу, США) [88].
Культури клітин ссавців: культура 293Т -клітини епітелія нирок людини, що є похідними клітин НЕК 293 і експресують великий Т-антиген SV40, завдяки чому в них підвищується рівень експресії плазмід, що містять SV40 промотор. Cos-1 -фібробласто-подібні клітини нирок африканської зеленої макаки, експресують Т-антиген SV40. Клітини NIH 3T3 -ембріональні фібробласти миші, які високо чутливі до контактного інгібування. Клітини К562 -імморталізована лінія мієлоїдних клітин, яку було отримано від пацієнта із ХМЛ на стадії бластної кризи. Клітини К562 є Ph'-позитивними і також несуть додаткову перебудову t(15;17).
2.5. Методи
2.5.1. Отримання ДНК-конструкцій. ДНК-фрагменти РН та DH доменів гена bcr були синтезовані за допомогою двораундової ПЛР із використанням специфічних праймерів. кДНК хворих, що проходили д