РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ Й МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень та реактиви
Вивчення енергообміну сегменту тонкої кишки, в межах якого виконана ентеротомія й трансплантація ембріональних тканин, проведено на 110 кролях, яких розділено на 5 груп.
Першій групі тварин (28 кролів) виконано алотрансплантацію ембріона- льної очеревини, другій (28 кролів) - алотрансплантацію ембріональної шкіри. Кожній тварині пересаджено 3 клапті ембріональної тканини на незашиті рани тонкої кишки за загальноприйнятою методикою.
Окремі дві групи (контрольні) склали тварини, в яких досліджували процеси енергообміну в звичайних умовах (12 кролів) та після ентеротомії, виконаної за прийнятою методикою з однорядним швом рани кишки (12 кролів). 30 кролям пересаджено ембріональні остеобласти в кісткову рану.
Кров для досліджень (10 мл) забирали із нижньої порожнистої вени після її катетеризації катетером діаметром 0,6 мм. Кролів виводили з експерименту на 3, 7, 14, 30, 60, 90, 180-й день після операції шляхом пропускання електричного струму через спинний та довгастий мозок.
Виконували серединну лапаротомію, проводили резекцію досліджуваного сегменту тонкої кишки, відділяючи кишкову трубку від брижі. Кишку розтинали вздовж брижеєчного краю й відмивали декілька разів охолодженим до температури +4° С ізотонічним розчином хлориду натрію, висушували фільтрувальним папером і переносили на льодяну баню.
Експерименти проводились у відповідності до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях.
Об'єктом досліджень слугували препарати отримані з ембріональних тканин (очеревина, шкіра) та клітин (остеобласти), до та після алотрансплантації зрілому реціпієнту, а також препарати отримані з тонкої кишки зрілої особини.
При проведенні досліджень використовували реактиви фірм " REANAL", "LACHEMA".
Рис. 2. 1. Досліджувані показники енергообміну
2. 2. Методика ентеротомії, виділення та трансплантації ембріональних тканин та клітин
Методика ентеротомії
Тварини оперовані через 30 хв після стандартної премедикації (атропін 0,1 % р-н 25 - 30 мг/кг, димедрол 1,0 % р-н 10 - 20 мг/кг, промедол 1,0 % р-н 6 - 10 мг/кг) під комбінованим дом'язовим наркозом (кеталар 8 - 10 мг/кг, гексенал 1% р-н 20 - 30 мг/кг, оксибутират натрію 20 % р-н 80 - 100 мг/кг).
Операцію виконували із середньо-серединного лапаротомного доступу. Після ревізії органів черевної порожнини, при відсутності патології у рану виводили петлю тонкої кишки. Відтак проводили поздовжну ентеротомію довжиною 1,5 - 2,0 см. Рану кишки зашивали вузловими однорядними повздовжніми швами. Лапаротомну рану зашивали поодинокими вузловими швами через усі шари. У післяопераційному періоді медикаментозної терапії не проводили, тварини перебували в звичайних умовах.
Методика виділення та трансплантації ембріональної шкіри та очеревини
Донором служила самка в кінці другого чи на початку третього тижня вагітності. Матеріал для трансплантації забирали безпосередньо перед операцією. В операційній зі строгим дотриманням асептичних умов під наркозом виконували екстирпацію матки й видаляли ембріони. Ембріони відмивали ізотонічним розчином хлориду натрію. Після обробки шкіри йодонатом підковоподібним розрізом з двох сторін від здухвинних ділянок вертикально вверх і потім паралельно реберним дугам викроювали клапоть передньої черевної стінки. За допомогою мікрохірургічної техніки сепарували шкіру та м'язово-апоневротично-очеревинний пласт, який в подальшому умовно називали очеревиною. Виділити окрему очеревину було неможливо оскільки епітеліальні пластинки товщиною менше 0,1 мм не вдається забирати інструментами [97]. З тканин викроювали клапті діаметром 1,5 - 2,0 см й переносили в розчин Колінза, в якому й зберігали при температурі +4° С до моменту трансплантації. Після виконання операції ентеротомії поверх незашитої рани накладали латку ембріональної тканини, яку фіксували з допомогою 4-х діаметрально протилежних серозно-м'язових швів.
Методика виділення та трансплантації ембріональних остеобластів
Для виділення остеобластів використовували росткові зони трубчатих кісток кінцівок трьохтижневого ембріона кроля. Під мікроскопом МБІ-6 при чотирьохразовому збільшенні в умовах темного поля локалізували росткові зони кісток і висікали їх. Одержаний матеріал гомогенізували.
Дефект кісток передпліччя створювали, випилюючи за допомогою фрези сегмент діафізу довжиною 2 см. Застосування фрези давало змогу сформувати рівну ранову поверхню, уникнути розпилення кістки в рані, зберегти сусідню кістку, яка надалі ставала опорною й, таким чином, створити одинакові умови остеогенезу для обох кінцівок. Дефект кістки однієї з кінцівок заміщали трансплантатом, друга кінцівка слугувала контролем.
Для одномоментної трансплантації використовували 200 300 мг клітинної суспензії. Перед операцією клітинну масу фіксували за допомогою фібринового клею, моделюючи одночасно й дефект кістки. Розчини компонентів фібринового клею готували безпосередньо перед застосуванням, для чого 100 мг фібриногену розчиняли в 1 мл гордоксу (20 тис. ОД) і 100 ОД тромбіну в 1 мл розчину Рінгера, збагаченому іонами кальцію в концентрації 0,1 - 0,11 мг%. Відтак компоненти підігрівали до температури 36 - 37° С, зберігаючи їх до моменту використання.
Трансплантат фіксували за допомогою фібринового клею, що давало змогу адекватно відтворити кістковий дефект (чим попереджувалося надмірне розростання кісткової тканини в майбутньому), зупинити кровотечу з ранової поверхні та надійно фіксувати трансплантат у рані. Операцію виконували у статевозрілих самців під внутрім'язовим гексенал-кеталаровим наркозом.
2.3. Отримання мітохондріальної і цитоплазматичної фракцій клітин
Дослідження проводились за методикою диференціального центрифугування Джонсона та Ларді [125]. Тканину подрібнювали, зважували на торзійних терезах, додавали середовище виділення, що містить 0,25 М сахарози, 1 мМ ЕД