ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И
КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Для решения поставленных задач исследования проводились в следующих направлениях.
1. Изучение механизмов взаимовоздействия криоконсервированных фетальных клеток с организмом реципиента, их влияние на репаративно-регенеративные процессы в ранние и отдаленные сроки после проведенного лечения при экспериментальной модельной патологии органа зрения.
2. Идентификация, определение путей миграции и временных параметров функционирования фетальных нервных клеток в организме экспериментальных животных.
3. Изучение влияния криоконсервированных фетальных клеток на функциональные офтальмологические показатели, изучение эффективности предложенного метода лечения при ЦХРД.
2.1. Экспериментальные наблюдения
В работе использовалиось 88 половозрелых кроликов породы Шиншилла массой 1,5-2,5 кг, которые содержались в стандартных условиях вивария Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины и Харьковской медицинской академии последипломного образования при нормальном освещении и кормлении. Исследования проводились согласно национальным "Общим этическим принципам экспериментов на животных" (29.09.01), которые согласуются с положениями "Европейской конвенции про защиту позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 1985).
Для экспериментальных и клинических исследований использовали иммунобиологический препарат "CRYOCELL" (нервные клетки) изготовленный в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины согласно методическим рекомендациям [7, 27, 42].
Иммунобиологический препарат "CRYOCELL" (нервные клетки) хранится в низкотемпературном банке в ИПК и К НАН Украины в жидком азоте при температуре минус 196°С. Препараты полноценно тестирован на бактериологический и вирусологический контроль, согласно требованиям к иммунобиологическим препаратам. Использование иммунобиологического препарата подтверждается "Сертифікатом про державну реєстрацію імунобіологічного препарату "Cryocell" № ДР 371/03-300200000 від 29.05.2003 р. и № ДР 604/06-300200000 від 04.07.2006 р.".
Для изучения влияния криоконсервированных фетальных нервных клеток (КФНК) на репаративно-регенеративные процессы в сетчатке выбрана модель лазерного ожога сетчатки. Лазерное повреждение сетчатки всем кроликам осуществляли с помощью аргоновой лазерной установки Visulas - 532 (CARL ZAISS, Германия). Коагуляты наносились в нижней половине глазного дна через грань трех зеркальной линзы по 10-15 коагулятов на каждом экспериментальном глазу. Экспериментальными глазами у кроликов всех групп служили правые, а контрольными были левые глаза. Средняя мощность излучения 400мВт, длительность экспозиции 0,1 сек, диаметр пятна 100 мкм. По классификации L`Esperance световой ожог в таких случаях соответствовал третьей степени [143].
Проведена серия экспериментальных исследований по изучению нейротрофических факторов на репаративные процессы в сетчатке после лазерного ожога сетчактки.
Определение нейротрофических факторов проводили в сыворотке крови экспериментальных животных при использовании тест систем SPECIAL INFORMATION REGARDING BIOTRAK TGF ?-1 (Transforming Growth Factor Beta-1) and GNF (Growth Neural Factor) human, ELISA System фірми Аmersham Pharmacia Biotech.
Исследования нейротрофических факторов проводили у кроликов трех экспериментальных групп, всего 36 кроликов:
1. Первая группа - интактные кролики, без лазерного повреждения сетчатки (десять штук).
2. Вторая группа - контрольная:
а) кролики с самопроизвольным заживлением лазерного ожога сетчатки (шесть штук);
б) кролики с лазерным ожогом сетчатки, леченные по схеме стандартной терапии (шесть штук);
3. Третья группа - основная:
а) кролики с лазерным ожогом сетчатки, у которых проведен курс лечения с внутривенным применением КФНК (семь штук);
б) кролики с лазерным ожогом сетчатки, у которых проведен курс лечения с парабульбарным применением КФНК (семь штук).
Стандартная лечебная схема включала введение сосудистых препаратов (милдронат, трентал, пикамилон, кавинтон), витаминных (мильгама, нейрорубин), а также местное введение этих препаратов совместно с эмаксипином.
Введение КФНК осуществляли методом внутривенного и парабульбарного введения на фоне проводимой стандартной терапии.
Для определения уровня нейротрофических факторов (TGF ?-1, GNF), кровь у кроликов забирали прижизненно из ушной вены в объеме 2-3 мл.
Показатели продукции нейротрофических факторов в плазме крови у кроликов изучали на 3-е, 7-е, 14-е, 21-е сутки и отдаленные сроки наблюдения один и шесть месяцев.
Определение пути и времени миграции криоконсервированных фетальных нервных клеток в ранние сроки наблюдения (трое суток) проводили молекулярным методом исследования при помощи генетической метки (Y-хромосомы) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Была использована одна экспериментальная группа животных - 21 кроль. Перед введением фетальных нервных клеток в клеточную суспензию вводили клетки положительные по Y-хромосоме.
Приготавливали ряд образцов клеток, содержащих в геноме локус гена SRY, определяющего пол. Заранее измеряли в них методом ПЦР присутствие локуса гена SRY и клетки, положительные по Y-хромосоме, использовали для введения лабораторным животным женского пола.
Клетки, содержащие Y-хромосому, вводили кролям парабульбарно в дозе 0,5 мл с количеством клеток 0,3?106 мл.
Забой животных проводили через 6, 12, 24, часа и на третьи сутки после введения, изымали исследуемые органы: структуры глазного яблока (сетчатую и сосудистую, радужку оболочки и зрительный нерв правого и левого глаза), костный, продолговатый, головной мозг и мозжечок, и делали навески ткани весом 50-70 мг. Навески помещали в стерильные пробирки и исследовали.
По наличию специфического фрагмента амплификации размером 336 пар нуклеотидов судили о присутствии фетальных к
- Київ+380960830922