РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для досягнення поставленої мети і виконання завдань дисертаційної роботи впродовж 2004-2007 років в умовах віварію Білоцерківського національного аграрного університету були проведені експериментальні дослідження на 800 головах перепелів. Птиця утримувалася в клітинних батареях за умов, що відповідають зоотехнічним нормам. Годували птицю штучно виготовленим комбікормом (дерть кукурудзяна - 21 %, дерть пшенична - 22 %, дерть ячмінна - 10 %, дерть горохова - 20 %, шрот соєвий - 5 %, шрот соняшниковий - 10 %, рибне борошно - 6 %, дріжджі - 2 %, крейда - 2 %, сіль - 1 %, премікс - 1 %), збалансованим по обмінній енергії, протеїну, клітковині, макро- і мікроелементам, вітамінам (див. Додаток А), за вільного доступу до води і кормів. Для напування використовувалася вода з місцевих артезіанських свердловин. Площа підлоги в клітках при утриманні становила не менше 85 см2 на голову. Освітлення батарей, де утримувалась птиця, здійснювалося природнім світлом, в сутінках і вночі - лампами денного світла.
Проводились лабораторний і виробничий досліди. Для лабораторних досліджень використано 400 гол. птиці, у виробничих дослідах - 400 перепелів. Лабораторний дослід тривав 22 тижні. З однодобових пташенят за принципом аналогів (за віком і масою тіла) було сформовано чотири групи по 100 голів у кожній. У піддослідної птиці вивчались вміст загальних ліпідів, інтенсивність ПОЛ та показники білково-нуклеїнового обміну в яєчнику. Досліди проводили за схемою: I група - інтактна птиця (контроль) - отримувала корм, що містив рекомендовану добову норму вітаміну Е (30 мг/кг); II група - птиця отримувала корм з вмістом вітаміну Е 20 мг/кг; III група - птиця даної групи отримувала корм з вмістом вітаміну Е 300 мг/кг; IV група - птиця отримувала корм з вмістом вітаміну Е 600 мг/кг. Вітамін Е (?-токоферол ацетат) додавали до корму у вигляді 10 % розчину в олії з 1-ої по 154-ту добу досліду.
При проведенні лабораторних дослідів, крім вивчення головних біохімічних показників, вивчався вміст вітаміну Е в яйцях перепелів. Для цього від кожної групи досліджуваної птиці в пік яйценосності (22 тижні) бралось п'ять яєць і вивчався вміст вітаміну Е в складі жовтка.
Виробничий дослід проведено на двох групах птиці по 200 голів кожна. Перепелам I групи згодовували комбікорм, що містив рекомендовану добову норму вітаміну Е (30 мг/кг). Птиця II групи в комбікормі мала вміст вітаміну Е, збільшений у 10 разів - 300 мг/кг.
Під час дослідів отримували матеріал для дослідження - яєчник та яйця. При вивченні яєчника використовувалися анатомічні, гістологічні, гістохімічні, біохімічні та статистичні методики. Дослідження проводилися у міжкафедральній науково-дослідній лабораторії біо- і гістохімічних досліджень (зав. лабораторією професор, доктор сільськогосподарських наук С.І. Цехмістренко). Матеріал для досліджень відбирали у 4-тижневому (неяйценосна птиця), 6-тижневому (початок яйцекладки) та 22-тижневому віці (пік яйцекладки), в один і той же час для виключення можливих добових коливань фізіолого-біохімічних параметрів. Яєчник отримували одразу після декапітації птиці під діетиловим етерним наркозом. Матеріал для фіксації негайно переносили в холодильник, при необхідності - в певні фіксуючі рідини, передбачені відповідними методиками. Для проведення таких досліджень від кожної дослідної групи птиці брали, як правило, 7 зразків (n = 7).
Головною анатомічною методикою було препарування. Яєчник отримували від щойно забитої птиці - виділяли його скальпелями, препарувальними голками, очищали від сполучнотканинних оболонок, крові та поміщали в холодильник. Вивчали його масу, зовнішній вигляд: розмір, довжину, ширину, товщину, колір. Для гістологічних і гістохімічних досліджень одразу після видалення яєчника з організму готовилися зрізи на кріостаті-мікротомі або переносилися кусочки органа в фіксуючі рідини.
Головним гістологічним методом, який використовувався в роботі, було фарбування гістологічних зрізів гематоксиліном-еозином. Препарати найчастіше слугували контролем для постановки гістохімічних реакцій. Матеріал для гістологічних препаратів фіксувався в 10-15-процентному розчині нейтрального формаліну, для визначення загальних ліпідів - в рідині Бекера, нуклеїнових кислот, загальних, кислих та основних білків - у рідині Карнуа. Заливка в парафін проводилася за Г.А. Меркуловим [108]. Парафінові зрізи приготовлялися на санному мікротомі МС-2. товщина зрізів не перевершувала 10-15 мкм. З частини свіжого матеріалу в окремих випадках готувалися заморожені препарати на мікротомі-кріостаті МК-25.
В роботі оглядові препарати фарбували гематоксиліном-еозином, локалізація загальних ліпідів на гістохімічних препаратах виявляли за допомогою постановки реакції з суданом чорним В за Лізоном [108], сумарних нуклеїнових кислот - адсорбції хромових галунів по Ейнарсону [108], роздільне виявлення ДНК і РНК - за методом Браше [147], загального білка - за І.В. Шустом [108], основних та кислих білків - за методом Мікель-Кальво [108]. Для мікроскопічного вивчення препаратів використовували мікроскоп "OLYMPUS CK 20", для мікрофотографування - фотоапарат "Зеніт-Е" (Росія).
При проведенні біохімічних досліджень яєчник подрібнювали в гомогенаторі Поттера-Елвегейма з тефлоновим товкачиком. До 100 мг гомогенату яєчника додавали 6 мл ізотонічного розчину. Отриману фракцію гомогенату центрифугували (3000 об./хв.).
Вміст загальних ліпідів визначали за допомогою наборів реактивів для визначення загальних ліпідів [102]. Продукти розпаду ненасичених ліпідів, після гідролізу сірчаною кислотою, взаємодіють з фосфорнованіліновим реактивом з утворенням забарвленого у рожевий колір комплексу, що має максимум поглинання при довжині хвилі 530 нм. Кількість загальних ліпідів виражали у мг на 1 г яєчника.
Стан пероксидного окиснення ліпідів досліджували за вмістом його продуктів. Визначення гідропероксидів ліпідів проводилося спектрофотометрично за допомогою кольорової реакці