РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Наше дослідження проведено на 138 білих безпородних лабораторних щурах-самцях, яким на початку експерименту було 2,2 місяці масою 150-170 г. Вибір тварин пов'язаний з функціонуванням епіфізарного хряща і ростом довгих кісток протягом всього життя щурів [68, 115], високою швидкістю обмінних процесів [115] та близькими до людини загальними показниками водно-сольового обміну. Усе це дозволяє протягом незначного періоду простежити закономірності росту та формоутворення скелету у експериментальних тварин та екстраполювати результати з певною вірогідністю на людину, що дозволить робити прогнози розвитку порушень водно-сольового гомеостазу при подібних патологіях.
Тварини були розділені на підгрупи в залежності від вихідного стану вегетативної нервової системи. Останню визначали, використовуючи математичний аналіз серцевого ритму попередньо проведених інтервалокардіографій у щурів [15, 16, 182]. Кардіограми записували вранці (з 9 до 11 години) після 5-хвилинного перебування тварини в горизонтальному положенні при спокійному диханні у спеціально сконструйованих касетах. Для розрахунку використовувалося 100 знятих кардіоінтервалів у ІІ стандартному відведенні. Критеріями оцінки вегетативного статусу були використані показники варіаційного розмаху серед яких: (?Х) - різниця між максимальним і мінімальним інтервалом R-R; мода (Мо) - величина тривалості інтервалів R-R, що найчастіше зустрічаються); амплітуда моди (Амо) - кількість інтервалів R-R, що відповідали значенню моди; індекс напруження регуляторних систем (ІН) - індекс напруження Р.М. Баєвського; коефіцієнти варіації (КВ) - ступінь варіативності значень кардіоінтервалів (відображає сумарний ефект регуляції ритму ВНС); індекси вегетативної рівноваги (ІВР) - відношення, що існує між активністю симпатичного і парасимпатичного відділів ВНС і визначається за співвідношенням амплітуди моди до варіаційного розмаху (Амо/?Х) [16, 34, 182].
На основі проведеної роботи провели селекцію та розподілили тварин в залежності від тонусу їх автономної нервової системи на три групи, кожну з яких поділили на дві підгрупи:
а) К - контрольна (інтактна);
б) Е - експериментальна.
Таким чином, ми одержали такі групи тварин: 1-а - Кs та Еs групи - щурі з вираженим симпатотонічним типом автономної нервової системи; 2-а - Кn та Еn групи - щурі з урівноваженим типом АНС; 3-я - Кр та Ер група - щурі з парасимпатикотонічним типом АНС.
Контрольні тварини знаходилися у звичайних умовах віварію і утримувалися згідно "Санитарных правил создания, оборудования и содержания экспериментально-биологических клиник (вивариев)" від 06.04.1973 р. і доповнень від 04.12.1978 р. до Наказу МОЗ СССР № 163 від 10.03.1966 р. "О суточных нормах питания животных и продуценты" та "Загальних і етичних принципів експериментів на тваринах" [65].
Тварин експериментальних груп адаптували до клітинного зневоднення (І етап), потім на них моделювали важкий ступінь гіпертонічної гідратації (ІІ етап), а далі переводили на звичайний харчовий режим віварію для вивчення реадаптаційних змін в довгих кістках (ІІІ етап). Після кожного етапу вилучали з експерименту по одній групі із шести щурів з різним типом АНС. Контрольні групи виводили на початку експерименту з метою виявлення особливостей морфології плечових кісток та їх хімічний склад у тварин з різним типом АНС, а також паралельно з експериментальними для одержання величин для порівняння.
Модель адаптації до клітинного зневоднення ґрунтувалася на методиці індукції клітинного зневоднення через циклічне згодовування експериментальним тваринам пересоленої їжі та води протягом 2-х діб та звичайної дієти віварію протягом 3-ої доби. За 42-і доби щурі пройшли 14 подібних тренувальних циклів.
Тяжкий ступінь клітинного зневоднення викликали безперервним згодовуванням пересоленої їжі та води щурам протягом 30 діб. Загальна тривалість експерименту склала 114 діб. Кількісний розподіл тварин в групах представлений у таблиці 2.1.
Для визначення ступеня клітинного зневоднення тваринам за дві години до декапітації внутрішньоочеревинно вводили 3 % розчин родонату натрію. При виведенні тварини з експерименту забирали кров, у якій вивчали концентрацію родонату натрію за Е.В. Берхіним та Ю.І. Івановим [18]. Величина останньої вказувала на кількість позаклітинної води. Тварину зважували, висушували до постійної ваги у сушильній шафі при t=105 ?C і визначали загальну вологу організму. Різниця величин загальної та позаклітинної вологи вказувала на кількість клітинної води.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин в експерименті адаптації, клітинного зневоднення та реадаптації
Група тваринВивчення структурних особливостей та хімічного складу плечової кісткиЕтапи проведення експерименту та його тривалістьАдапта-ція
(42 доби)Тяжке клітинне зневод-нення
(30 діб)Реадаптація7 діб21 доба42 добиКонтрольні
твариниКs666666Кn6Кp6Експериментальні
твариниЕs-66666Еn-66666Еp-66666 Всього 138 щурів
Тварин виводили з експерименту під ефірним наркозом методом декапітації з наступним скелетуванням і подальшим виділенням плечових кісток. Після чого кістки промивали дистильованою водою і просушували листками фільтрувального паперу. Кістки зважували на аналітичній вазі ВЛР-200 2-го класу точності.
Остеометрія проводилась згідно W. Duerst [214] з точністю до 0,1 мм. Вимірювались такі показники: найбільша довжина кістки, ширина проксимального епіфізу, ширина середини діафізу і ширина дистального епіфізу, передньо-задній розмір середини діафізу.
Мікроскопічно вивчались проксимальний метаепіфізарний хрящ довгих кісток, метафіз та компактна речовина діафіза. Для цього бралися фрагменти кістки із ділянки епіфізів і середини діафізів, котрі фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну, декальцинували трилоном Б.
Готували гістологічні зрізи 10-15 мкм завтовшки, які забарвлювали гематоксиліном та еозином, а