ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследование выполнено на 144 крысах самцах линии Вистар, которые содержались в условиях вивария Харьковской медицинской академии последипломного образования и. обеспечивались стандартным рационом питания. Животные делились на две возрастные группы: взрослые половозрелые - 10 - 12 месяцев (масса 230 - 365 г) и молодые в пубертатном периоде развития - 1,5 месяца (масса 75- 95 г). Каждая возрастная группа, делилась на четыре подгруппы: 1 - интактные (взрослые - 18; молодые -18), 2 - крысы, подвергавшиеся интенсивной физической нагрузке (плаванью до "отказа") (взрослые - 18; молодые - 18), 3 - животные, у которых воспроизводился экспериментальный гипотиреоз (взрослые - 18; молодые - 18), 4 - крысы с гипотиреозом, которые подвергались плаванью до "отказа" (взрослые - 18; молодые - 16).
Исследования проводились с соблюдением требований "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных".
2.1. Воспроизведение экспериментальных моделей
Для изучения эффектов интенсивной физической нагрузки животные подвергались плаванью до "отказа" в круглых пластиковых емкостях диаметром 40 см. Через час после прекращения плаванья крысы декапитировались под легким эфирным наркозом.
Модель экспериментального гипотиреоза воспроизводилась путем ежедневного в течение 15 дней внутрибрюшинного введения антитиреоидного препарата мерказолила на физиологическом растворе хлористого натрия из расчета 1 мг препарата на 100 г массы животного [152 ].
Эффективность воспроизведения экспериментального гипотиреоза контролировалась по концентрации в крови тиреоидных гормонов (Т3 и Т4) и ТТГ. Как видно из рис. 2.1, после курсового введения
Рис. 2.1. Изменение концентрации тиреоидных гормонов и ТТГ в крови крыс с экспериментальным гипотиреозом.
Примечания: по результатам исследований на 5 - 6 крысах. Светлые столбики - показатели у интактных крыс, темные столбики - показатели у крыс с гипотиреозом. * - Р < 0,05 к интактным.
мерказолила у животных обеих возрастных групп возникали характерные для гипотиреоза сдвиги, которые проявлялись в понижении содержания тиреоидных гормонов и увеличении концентрации ТТГ в крови [72, 90, 214].
2.2. Фракционирование гомогенатов полушарий головного мозга
Эвтаназия проводилась с помощью декапитации под легким эфирным наркозом. Извлекался головной мозг и собиралась кровь.
Кровь использовалась далее для получения сыворотки, в которой исследовалось содержание тиреоидных гормонов (тироксина и трийодтиронина) и ТТГ.
Мозг помещался в охлажденный до 4-6 оС 0,9% раствор хлористого натрия, помещенный в ледяную баню. Схема фракционирования гомогенатов полушарий головного мозга представлена на рис. 2.2.
Рис. 2.2. Основные этапы процедуры фракционирования гомогенатов больших полушарий головного мозга крыс.
Для получения субклеточных фракций, выделялись большие полушария головного мозга, отмывались о крови и подсушивались на фильтровальной бумаге. После этого на торсионных весах ВТ-500 готовились навески, которые подвергались гомогенизированию в течение 10 секунд (10 - 12 движений пестика) в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с тефлоновым пестиком при отношении массы ткани к объему среды выделения соответствующем 1:10, в условиях непрерывного охлаждения.
Среда выделения представляла собой 0,32 М раствор сахарозы (рН 7,4). Приготовленные гомогенаты фильтровались через 2 слоя марли, после чего центрифугировались в течение 10 минут при 1000 g в центрифуге ЦЛ-310b (Польша). Надосадок повторно центрифугировался 20 минут при 10000g в угловом роторе рефрижераторной центрифуге РС-6. Осадки, полученные после этого центрифугирования, суспензировались с 5 мл среды выделения и подвергались повторной очистке при аналогичном режиме центрифугирования. Очищенный осадок суспензировался с 1 мл среды выделения или физиологического раствора хлористого натрия и использовался в качестве грубой митохондриальной фракции.
Супернатант, полученный после первого осаждения пробы при 10000g, представлял собой постмитохондриальную фракцию, которая использовалась получения микросом.
Для выделения микросом из постмитохондриальной фракции, в пробы последних добавлялась смесь хлористого кальция и хлористого магния, до конечных концентраций 8 мМ и 5 мМ соответственно [ 6 ]. Образцы выдерживались при 4оС в течение 20 минут. После этого они подвергались центрифугированию при 3000g в течение 10 минут. Осадок суспензировался с 1 мл среды выделения или физиологического раствора хлористого натрия и использовался в качестве грубой микросомальной фракции.
Все процедуры, связанные с фракционированием полушарий головного мозга, проводились при 0 - + 040 С.
Пробы митохондриальной, постмитохондриальной и микросомальной фракции больших полушарий головного мозга исследованных животных до проведения исследований хранились при -200 С
2.3. Изучение свободнорадикальных процессов
Для оценки проявлений оксидативного стресса в субклеточных фракциях больших полушарий головного мозга в них проводилось определение концентрации продуктов свободнорадикального окисления липидов и белков, а также измерялась скорость индуцированных прооксидантами свободнорадикальных процессов
2.3.1. Методы определение концентрации продуктов свободнорадикального окисления белков и липидов
В субклеточных фракциях больших полушарий головного мозга измерялось содержание продуктов свободнорадикального окисления белков (карбонилированных белков) и липидов (диеновых конъюгатов и флюоресцирующих конечных продуктов типа шиффовых оснований).
2.3.1.1. Определение концентрации карбонилированных белков
В основу количественного определения содержания карбонилированных белков в