РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для вирішення поставлених завдань нами було проведено дослід на поросятах великої білої породи. Досліджували вплив ГХН на функціональні і структурні зміни головного мозку на тлі експериментального Т-2 токсикозу у свиней. Дослідження проводили на базі Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів та кормових добавок та кафедри біофізики та біоінформатики Львівського національного університету імені Івана Франка.
Експериментальну частину роботи проводили на різностатевих поросятах великої білої породи, віком 2,5 місяці, вагою 18-20 кг. Об'єкт дослідження - свині (Sus scrofa domestica) - належить до нежуйних ссавців родини свиней, ряду парнокопитних. Обмін речовин, морфологічна будова шкіри і кінетика утворення епітелію покривів у свиней дуже подібні до людських. Доведена схожість систем гістосумісності свині і людини при аналогічних розмірах тіла і її маси. Це стало основою для використання свиней в експериментальній хірургії при вирішенні проблем трансплантації судин, серця, нирок, печінки, клапанів аорти. Свині зручні для проведення фармакологічних і токсикологічних досліджень, експериментів в галузі ендокринології, фізіології, імунології. Чутливість свиней до збудників інфекційних захворювань дозволяє використовувати їх для моделювання цих захворювань [98].
Для відтворення експериментального Т-2 токсикозу використовували корм, що містив Т-2 токсин. Як детоксикаційний препарат використовували ГХН ("Септокс") виробництва Українського державного хіміко-технологічного університету, м. Дніпропетровськ.
Впродовж досліду звертали увагу на загальний вигляд та поведінку тварин, шкірний покрив, стан видимих слизових оболонок, апетит, рухливість, час виникнення інтоксикації.
Розтин тварин, відбір проб тканин головного мозку, замороження у рідкому азоті, фіксацію та виготовлення гістопрепаратів здійснювали за загальноприйнятими методиками [108]. Дослідження гістопрепаратів проводили за допомогою мікроскопа МБР-3 при збільшеннях х200, х400 та х900. Мікрофотографування проводили фотокамерою OLYMPUS CX 41, яка під'єднана до мікроскопа OLYMPUS і комп'ютера SAMSUNG.
Дані досліджень обробляли статистично з вираховуванням середніх арифметичних величин М, середньої квадратичної похибки ? та відхилення від середнього арифметичного m між показниками [49, 99]. Статистичну обробку усіх даних результатів досліджень, кореляційний аналіз проводили з використанням програми "Excel-2003" для Windows.
Для оцінки достовірності різниці між статистичними характеристиками двох альтернативних сукупностей даних обраховували коефіцієнт Стьюдента. Достовірною вважалася різниця при показнику достовірності р?0,95 (або рівні значимості Р<0,05), р?0,99 (або рівні значимості Р<0,01), р?0,999 (або рівні значимості Р<0,001). Результати обробки виводилися у вигляді таблиць. З метою відтворення Т-2 токсикозу дослідження проводились за такою схемою.
Схема досліду:
Тварин розділили на 3 групи (по 8 тварин у кожній). Першій групі (контрольній) згодовували доброякісний, повноцінний корм і випоювали воду. Тваринам другої та третьої (дослідних) груп 20 діб згодовували комбікорм, до складу якого входила дрібно змелена кукурудза, контамінована Т-2 токсином (вміст Т-2 токсину в комбікормі становив 61 мкг/кг корму) і випоювали воду. Починаючи з 10-тої доби тваринам ІІІ групи замінювали воду на розчин ГХН ("Септокс") в концентрації 200 мг/л та продовжували згодовувати корм, уражений Т-2 токсином.
На 10-ту і 20-ту доби по 4 тварини з І, ІІ та ІІІ груп забивали, використовуючи ефірний наркоз, видаляли головний мозок. Відбирали шматочки з лобних ділянок кори головного мозку, мозочка (кори), довгастого мозку (захоплювали ретикулярну формацію, міст). Шматочки тканин відмивали в фізіологічному розчині. Для дослідження матеріал заморожували у рідкому азоті. Наважки ділянок мозку (1-2 г) гомогенізували при низькій температурі на гомогенізаторі в присутності буферного розчину А (0,32М сахарози, 1мМ ЕДТА, 50мМ трис-НСl, рН=7,4) [114]. У кожній з ділянок головного мозку визначали рівень перекисного окиснення ліпідів (інтенсивність ПОЛ оцінювали за вмістом первинних та вторинних продуктів пероксидації ліпідів - ДК та МДА) [162, 172] та активність СОД [84], ГПО [112], ГР [137], КАТ [81]. Вміст білка визначали за методом Лоурі.
Шматочки розміром 0,5 х 1 см фіксували в 15 %-й нейтральному формаліні для гістологічного дослідження. Гістологічні препарати виготовляли за загальноприйнятими методами. Сагітальні гістозрізи фарбували гематоксиліном та еозином та за методами Ніссля, Ван-Гізона.
2.1. Визначення первинних та вторинних продуктів перекисного окиснення ліпідів
2.1.1. Визначення вмісту дієнових кон'югатів
Реактиви:
1) Реактив А (Н-гептан: ізопропіловий спирт у співвідношенні 1:1);
2) етиловий спирт.
0,2 мл гомогенату змішували з 1,8 мл реактиву А, після чого інкубували при кімнатній температурі 30 хв. Проводили фільтрацію і до надосадової рідини додавали по 3 краплі води. Суміш добре струшували. До гептанової фази (0,5 мл) додавали по 2 мл етанолу. Екстинкцію вимірювали на кварцовій лампі при довжині хвилі ? = 233 нм [162].
Обрахунок проводили за формулою:
мкмоль/мг білка,
де [ДК] - вміст дієнових кон'югатів у пробі;
?Е - різниця екстинція холостої і дослідної проб;
Ve - кінцевий об'єм верхнього гептанового шару;
V - об'єм гомогенату тканини;
? - молярний коефіцієнт екстинції, дорівнює 28000 М-1·см-1, у розрахунках використовували мілімолярний коефіцієнт екстинції, виражений як 28 см2/мкмоль;
С - концентрація білка в гомогенатах.
Отримані результати виражали в мкмоль/мг білка.
2.1.2. Визначення вмісту ТБК-позитивних продуктів
Принцип методу грунтується на активації ПОЛ іонами двовалентного заліза до рівня, який реєструється спектрофотометрично. При високій температурі в кислому середовищі МДА реагує з ТБК, утворюючи забарвлений триметино