РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований
В экспериментах были использованы свежие эритроциты человека, крысы и петуха, которые дважды отмывали в незабуференном физиологическом растворе путем центрифугирования (3000 об/мин, 2 мин), на центрифуге ОПН-3, а затем осадок разводили в 10 раз в изотоническом растворе HBS (150 мМ NaCl, 5 мМ HEPES, pH 7,4) и использовали как сток-суспензию. Эритроциты человека ІІ группы получали из клинической лаборатории Института медицинской радиологии имени С.П. Григорьева АМН Украины, которые забирали в вакуумные пробирки Vacutainer, содержащие в качестве антикоагулянта цитрат натрия. Кровь у птиц (петух), содержащихся в стандартных условиях вивария Института экспериментальной ветеринарии УААН (Харьков), забирали из подкрыльцовой вены шприцом. Место забора предварительно дезинфицировали 70% этанолом. Кровь забирали в стерильную пробирку на глюгицировом консерванте в объемном соотношении 9:1. Кровь крыс линии Vistar, которых предварительно наркотизировали диэтиловым эфиром и декапитировали, забирали в пробирки, предварительно обработанные гепарином (5000 Е). Образцы хранили в холодильнике и использовали в день забора.
2.2. Измерение динамики изменения формы и гемолиза эритроцитов на формометре-агрегометре ФА-01
Для изучения динамики изменений формы эритроцитов во времени после различных воздействий использовали разработанный и изготовленный в ИПКиК НАН Украины двухканальный формометр-агрегометр ФА-01, который, наряду с измерением оптической плотности (ОП) или светопропускания, измеряет флуктуации интенсивности светового потока, которые несут информацию о форме клеток [2, 3]. В ФА-01 применено специальное устройство, состоящее из фильтра низких частот, который выделяет высокочастотную составляющую интенсивности светового потока, масштабного усилителя и последующего программного блока обработки, который вычисляет среднеквадратичное значение амплитуды флуктуаций светового потока. Индекс формы (ИФ) рассчитывался по протоколу, описанному ранее для определения формы эритроцитов [2, 3] и вычислялся по формуле ИФ=k·D, где k - постоянный коэффициент, зависящий от коэффициента усиления сигнала и от калибровки прибора, а D - среднеквадратичное значение амплитуды флуктуаций светового потока, которое вычисляли на интервале усреднения равном 1 с. Калибровочный коэффициент k, который отражает степень дискоидности эритроцитов, позволяет сформировать шкалу измерений ИФ,
В цилиндрическую стеклянную или пластиковую кювету диаметром 10 мм, содержащую 2 мл HBS, добавляли 10-12 мкл сток-суспензии эритроцитов таким образом, чтобы начальное значение ОП было в пределах 0,30?0,02, что соответствует концентрации эритроцитов порядка 6?106 в 1 мл. Суспензия клеток перемешивалась магнитной мешалкой со скоростью 600 об/мин. Для изменения формы эритроцитов в кювету добавляли от 5 до 100 мкл концентрированных растворов исследуемых веществ до заданной конечной концентрации и регистрировали изменения ОП или ИФ во времени.
Динамика морфологических изменений изучалась при введении клеток в незабуференную среду, содержащую 300 мМ сахарозы (Merck), рН 5,8-6,2. Изменение электролитного и качественного состава этого раствора осуществляли путем замещения его части (от 20 до 200 мкл) изотоническим раствором соответствующей соли или концентрированного раствора соответствующего реагента (ингибитора). В отдельных экспериментах модификаторы (от 5 до 40 мкл) добавляли непосредственно в кювету из концентрированных растворов до получения заданной конечной концентрации через 150 с после введения туда клеток.
2.3. Метод оптической микроскопии
Стационарная морфологическая картина клеток в кювете контролировалась с использованием метода оптической микроскопии. Для этого 2-3 мкл клеточной суспензии из измерительной кюветы наносили на предметные стекла с лунками (Санкт-Петербург, Россия) и накрывали покровным стеклом. Образцы анализировали и фотографировали в тонком жидком слое без применения фиксирующих агентов, чтобы учесть эффект стекла [55] в светлом поле на микроскопе Биолам-М.
2.4. Исследование транспорта Н+ в сахарозных средах методом рН-метрии
Эритроциты человека дважды отмывали безбуферным раствором 0,15 М NaCl по стандартной методике и 50 мкл эритромассы вносили в 2 мл раствора сахарозы (0,3 М, конечный гематокрит 2%), содержащего и не содержащего необходимую концентрацию ингибиторов анионного транспорта или иных реагентов, и далее регистрировали изменение рН раствора во времени. Измерения проводили при комнатной температуре 20-22°С. Внутриклеточный рН в эритроцитах определяли по значению рН в 2 мл Н2О после переноса туда 50 мкл эритромассы и полного гемолиза клеток.
На рисунках представлены типичные данные, от 3 до 5 независимых экспериментов, проведенных с кровью различных доноров при температуре 20-22?С.
2.5. Исследование транспорта флюоресцеина в эритроцитах
В этих экспериментах использовали консервированные эритроциты донорской крови человека ІІ группы. Перед экспериментом эритроциты отмывали 4 раза средой, содержащей в мМ: KCl - 90, NaCl - 45, сахароза - 44, глюкоза - 5. После этого эритроциты с гематокритом 5% пять раз по 10 минут инкубировали в указанной бреде, дополнительно содержащей фосфатный буфер (10 мМ, рН=7,4) для повышения внутриклеточного рН, поскольку внутриклеточный рН консервированных эритроцитов составляет 6,6 - 6,8. 50 мкл осадка эритроцитов вносили в среду инкубации объемом 2 мл (рН=7,4) с различной концентрацией ФЛ (5 - 400 мкМ) и инкубировали 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 минут при 37?С и 0, 5, 10, 20, 45 минут при 25?С. После инкубации эритроциты один раз отмывали холодной средой и полученный осадок лизировали на льду дистиллированной водой (2 мл). Далее осаждали гемоглобин 10% ТХУ на льду в течение 5 минут, центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин и в полученном надосадке доводили рН до 12, после чего измеряли уровень флюоресценции на сп