РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проведені протягом 2003–2007 років у лабораторії кафедри
біофізичних методів досліджень та на кафедрі технології та переробки продуктів
птахівництва Білоцерківського національного аграрного університету. Для
досягнення поставленої мети та завдань роботи було проведено шість серій
дослідів.
Рис. 2.1. Схема досліджень
Робота виконана на ембріонах курей породи адлерська срібляста та перепелів
породи фараон. Інкубацію здійснювали у лабораторному інкубаторі ИЛУ Ф–03 з
дотриманням стандартних вимог до процесу інкубації певного виду птиці [25,
147].
Враховуючи різні строки ембріонального розвитку перепелів і курей (21-а доба
для курей та 17-ть діб для перепелів) нами була запропонована відповідність
строків ембріонального розвитку для цих видів птиці.
Таблиця 2.1
Схема відповідності строків ембріонального розвитку курячих та перепелиних
ембріонів (схема складена за даними Рольник В.В., 1968)
Період розвитку
Замикання алантоїсу (а)
Перехід на білкове живлення (б)
Швидкий ріст постійних органів (в)
Початок прокльову (г)
Виведення молодняку (д)
Курячі ембріони
11-а доба
13-та доба
15-а доба
19-а доба
21-а доба
Перепелині ембріони
9-та доба
11-а доба
13-та доба
15-а доба
17-а доба
У першій серії дослідів досліджували інтенсивність пероксидного окиснення
ліпідів в тканинах мозку, серця, печінки, мембрани жовткового мішка та
залишковому жовтку курячих та перепелиних ембріонів та добової птиці. Для
кожного досліду формували по дві групи-аналоги інкубаційних яєць відповідного
виду, що були однакові за усіма ознаками (маса, термін зберігання, вік та умови
утримання птиці). Птицю батьківського стада, від якої брали інкубаційне яйце,
утримували у стандартних для кожного виду птиці в умовах за промислових норм
годівлі, щільністю посадки, норм освітлення та температурного режиму. До першої
групи було включено курячі ембріони та добові курчата, до другої – перепелині
ембріони та добові перепеленята.
Матеріал для визначення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів
відбирали на 9-, 11-, 13-, 15-у добу інкубації перепелів та 11-, 13-, 15-,
19-добових ембріонів курей, добових перепеленят та курчат. Ці терміни
відповідають основним етапам розвитку перепелиного та курячого ембріонів [37,
136]: зародковому періоду, передплідному, плідному періоду та періоду
виведення. Ембріони звільняли від оболонок, декапітували і відбирали мозок,
серце, печінку, мембрану жовткового мішка та залишковий жовток. Добових
перепеленят та курчат декапітували під легким ефірним наркозом, розтинали
черевну порожнину та відбирали зразки тканин печінки та серця; для видалення
мозку робили розтин черепу. Органи подрібнювали в гомогенаторі
Порттера-Ельвегейма з тефлоновим товкачиком. Гомогенати тканин готували у 50 мМ
Тріс-НСl буфері (рН=7,4) із розведенням 1:100. Отриману фракцію центрифугували
(3000 об/хв).
Рівень вторинних продуктів пероксидного окиснення ліпідів визначали
спектрофотометрично за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [5]. Основним
продуктом, що реагує з ТБК є малоновий діальдегід, 98% якого утворюється саме в
процесі руйнування гідроперексидів ліпідів [226]. Реакцію проводили у кислому
середовищі (рН=2,0) 1% ортофосфорної кислоти у присутності іонів двовалентного
заліза (FeSО4), що сприяло максимальному утворенню ліпоперексидів. Інкубацію
здійснювали у киплячій водяній бані протягом 30 хвилин. Реакцію зупиняли
охолодженням реакційної суміші у воді (). Оптичну густину досліджуваних проб
визначали в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см на спектрофотометрі
Spekol-11 (Німеччина) при л=535 нм. Вміст ТБК-реагуючих продуктів пероксидного
окиснення ліпідів виражали у мкмоль/г. В розрахунках враховували молярний
коефіцієнт екстинкції Е=156000 ммоль–1см–1.
Вміст загального білку в тканинах мозку, серця та печінки визначали за реакцією
біуретового реактиву. Принцип методу базується на здатності білків реагували з
сірчанокислою міддю в лужному середовищі з утворенням сполучень фіолетового
забарвлення (біуретова реакція). Інтенсивність фарбування реакційного розчину
прямо пропорційна концентрації білків в аналізованій сироватці (л=540 нм).
Калібрувальний графік будували використовуючи розчин кристалічного альбуміну.
У другій серії дослідів досліджували особливості функціонування АОС білкової
оболонки свіжого інкубаційного яйця та яйця після 20-ти діб зберігання. Для
кожного досліду формували контрольні та дослідні групи-аналоги інкубаційних
яєць відповідного виду. Було утворено по чотири дослідні групи кожного виду
птиці. До першої групи було включено свіже куряче інкубаційне яйце, до другої –
свіже перепелине інкубаційне яйце, до третьої та четвертої – куряче та
перепелине, відповідно, яйце після двадцяти діб зберігання при кімнатній
температурі ().
Білкову оболонку кожного яйця аналізували за активністю основних ферментів
антиоксидантного захисту (супероксиддисмутази, каталази, церулоплазміну та
глутатіонпероксидази). Для цього готували розведення „білка” на дистильованій
воді із додаванням 0,1 г NaCl на 1 мл „білка” (розведення 1:10).
Для визначення активності супероксиддизмутази застосовували метод [178],
заснований на здатності ферменту конкурувати з нітросинім тетразолієм за
супероксидні аніони. При аеробній взаємодії відновленого
никотинаміддинуклеотиду і феназинметасульфату з нітросинім тетразолієм та
супероксид-аніон радикалом відновлюється з утворенням гідразинтетразолія. За
присутності СОД відсоток відновлення нітросинього тетразолію зменшується.
Реакцію проводили при темп
- Київ+380960830922