Вы здесь

Ідентифікація білків-партнерів туберозно-склерозного комплексу TSC1/2 та характеристика виявлених взаємодій

Автор: 
Маланчук Оксана Миколаївна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2008
Артикул:
0408U005803
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та обладнання
В роботі використовували: центрифуги “MSE High Speed 18”, “Backman L-5”,
“Eppendorff 5447R”, „Microspin 24S DuPont” рН-метр “Hanna”, плашковий
денситометр "Anthos 2001", прилад для напівсухого електропереносу “Trans Blot
SD” фірми “Bio Rad” США, ламінарний бокс, СО2-інкубатор, інвертований
мікроскоп, спектрофотоколориметр, рентгенiвська плівка фiрми “AGFA” та інші,
амплiфiкатор “Eppendorf.
Використовували додецилсульфат натрію, персульфат амонію (“Bio-Rad”, США), трис
(“Sigma”, США), Vent полімераза (“New England Biolabs”, Велика Британія), лужна
фосфатаза із кишечника великої рогатої худоби (“Fermentas”, Литва), Т4 ДНК
лігаза (“Fermentas MBI”, США), кумасі діамантовий голубий R-250 та G-250,
акриламід, EDTA, TEMED, DMSO, DDT (“Serva”, Німеччина), Tween 20,
метиленбісакриламід, етідій бромід (“Sigma”, США), бромфеноловий синій, HCl,
KOH, CH3COOH, KCl, NaCl, NaH2PO4, KH2PO4, СаСl2, MgCl2, етанол, гліцин,
амінооцтову кислоту кваліфікації о.с.ч (вітчизняного виробництва), знежирене
молоко (“Marvel”, Велика Британія), легкоплавка агароза (“GIBCO”,
Великобританія), бензамідин, лейпептин, апротинін (“Amersham”, Велика
Британія), 2-меркаптоетанол, деоксихолат Na (“Merck”, ФРН), ФМСФ (“Calbiochem”,
Швейцарія), повний та неповний ад’ювант Фрейнда, PEG-1500 (“Sigma”, США), HAT
(“Sigma”, США), ABTS-буфер і ABTS-порошок (“Sigma”, США), фетальна сироватка
плоду корови, клітинна лінія мієломи SPI, миші лінії Balb/c.
Антитіла: LexA поліклональні антитіла кроля; поліклональні антитіла
кози, кон’юговані з пероксидазою хрону (“Life Technologies Inc”, Велика
Британія.)
Розчини антибіотиків: сульфат канаміцину, двонатрієва сіль карбеніциліну,
тетрациклін (спиртовий розчин), натрієва сіль ампіциліну.
Середовища для культивування еукаріотичних ліній клітин ссавців: DMEM (low and
high glucose) і RPMI виробництва «Invitrogen» (США).
Бактеріальні поживні средовища: LB (бакто-триптон, бакто-дріжджевий екстракт,
NaCl, рН 7,2-7,4), селективне Trp середовище.
Дріжджові середовища: YPD, YPD (агар), HULT (gal/dex), HUT (gal/dex), HU
(gal/dex), T (gal/dex), HUL (gal/dex), H (gal/dex), U (gal/dex).
До середовищ, що містять галактозу, як єдине джерело цукру, додавали рафінозу
до 1 %. Середовища стерилізували автоклавуванням за таких умов: 7 хв, 1210С,
1,5 Бар
X-gal: розчинити 100 мг X-gal у DMF, зберігати при -200С.
Розчин для виділення ДНК із дріжджових клітин: 85 мл дистильованої води, 2 %
Тритон Х-100, 1 % додецилсульфат натрію, 0,1 NaCl, 0,01 М трис (рН 8,0), 0,001
М ЕДТА.
Розчини для трансформації дріжджів: 10хLiOAc: 51 г ацетату літію (1М) розчинити
у 500 мл дистильованої води, стерилізувати автоклавуванням; 50 % PEG-3350: 250
г поліетиленгліколя-3350, довести до об’єму 500 мл дистильованою водою,
стерилізувати автоклавуванням.
Стоковий розчин для X-gal аналіза: на 100 мл - 93 мл калійного фосфатного
буфера, 6 мл DMF, 1 мл 10 % SDS.
Буферні розчини:
10х ТЕ: 100 мМ трис (рН 8,0), 10 мМ ЕDTA (рН 8,0);
1х ТАЕ: 40 мМ трис-ацетат, (рН 8,3) 1 мМ ЕDTA.
PBS: 150 мМ NaCl, 2 мМ KСl, 1,5 мМ Na2HPO4Ч2H2O, 1,5 мМ КH2PO4, рН 7,4; НСl.
Трис-гліциновий буфер для гель-електрофорезу за Лемлі: 25 мМ трис, 250 мМ
гліцин, 0,1 % SDS.
10х буфер для ПЛР: 100 мМ KCl, 100 мМ (NH4)2SO4 , 200 мМ трис, рН 8,8, 1 %
тритон Х-100, 20 мМ MgSО4.
10х лiгазний буфер: 660 мМ трис-НСI, рН 7,6, 66 мМ MgCl2, 6,6 мМ АТР, 100 мМ
ДТТ.
Z-буфер: 60 мМ Na2HPO4, 40 мМ NaH2PO4, 10 мМ KСl, 1 мМ Mg SO4, 50 мМ
2-меркаптоетанолу.
Буфер LiAc: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА, 100 мМ LiAc.
Буфер ТЕ/LiAc: 10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЕДТА, 100 мМ LiAc.
Буфер QBT: 50 мМ MOPS, pH 7,0, 750 мМ NaCl, 15 % ізопропанолу, 0,15 % Triton
X-100.
Буфер для промивки: 50 мМ MOPS, pH 7,0, 1 M NaCl, 15 % ізопропанол.
Буфер для елюції: 50 мМ трис-HCl, pH 8,5, 1,25 M NaCl, 15 % ізопропанол.
Буфер для ДНК-гель-електрофорезу (6х): 0,25 % бромфеноловий синій, 0,25 %
ксиленцiанол, 30 % глiцерин;
Буфер для напівсухого переносу для імуноблотингу: 25 мМ трис, 150 мМ гліцин, 10
% метиловий спирт;
Буфер для мокрого переносу для імуноблотингу: 25 мМ гліцин, 150 мМ трис, 20 %
метиловий спирт;
Блокуючий буфер для імуноблотингу: 0,05 % Tween, 5 % знежирене молоко у ЗФСР;
Розчин для реакції хемілюмінісценції: 100 мМ трис-HCl (pH 8,5), 0,02 %
5-аміно-2,3-дигідро-1,4-фталазиндіону, 0,004 % кумарової кислоти та 9 % Н2О2.
Розчини для очистки ДНК: Розчин І (50 мМ трис-HCl pH 8,0; 10 мМ EDTA); Розчину
II (200 мМ NaOH; 1 % ДСН), Розчину III (3 M KCH3COO, pH 5,5).
2.2. Плазміди, штами та клітинні лінії
Плазміди, що використовували у скринуванні за допомогою дріжджової двогібридної
системи:
репортерні плазміди - pSH18-34, pRB1840, pJK101.
Всі репортерні плазміди мали ген URA3 для селекції трансформованих клітин
дріжджів на ura— селективному середовищі. Плазміда pSH18-34 містила 8
операторних послідовностей для білка LexA в промоторі репортерного гена LacZ. У
плазміді pJK101 ген LacZ знаходиться під контролем промотора GAL1, між ним і
послідовністю гена LacZ містяться 2 операторні послідовності для білка LexA;
тестові/контрольні плазміди - pRHFM1, pSH17-4, pEG202-Max, pBait, pTarget.
Тестові/контрольні плазміди мали ген HIS3 для селекції трансформованих клітин
дріжджів на his— селективному середовищі. Плазміда pSH17-4 містила кДНК домена
транс-активації фактора транскрипції Gal4p, вбудовану в рамці з кДНК
послідовністю, яка кодує LexA. Ця плазміда використовується як позитивний
контроль активації транскрипції. Плазміда pEG202-Max експресує LexA-злитий
білок Max і використовується як позитивний контроль експресії
«байт»-конструк