РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Експериментальні моделі in vitro та in vivo.
Модель Е гіповітамінозу. Білих самців щурів лінії Вістар вагою 50-60 г було
розділено методом аналогів на 2 групи - контрольну та дослідну у співвідношенні
1:2. Тварини обох груп перебували протягом 70 діб на Е-гіповітамінозному
раціоні [101], що складався з казеїну, цукру, жиру свинячого, сольової суміші
Осборна Менделя для щурів та вітамінної суміші. Але тварини контрольної групи
одержували в раціоні вітамін Е у фізіологічних дозах. На 60 добу з тварин
дослідної групи, які не одержували вітамін Е, було відокремлено групу для
проведення корекції за допомогою вітаміна Е. Тварини цієї групи одержували
a-токоферол у фізіологічній дозі перорально протягом 10 діб.
Всі досліди на тваринах проводились згідно до протоколів гуманного відношення
до тварин.
Модель in vitro: Досліди проводились за участі комплексів токоферол-
токоферолзв’язуючий білок та токоферилхінон токоферолів’язуючий білок, які
отримувались у спеціально зробленій перфузійній камері [29].
2.2. Одержання ліпідних фракцій і визначення вмісту токоферолу, фосфоліпідів,
холестеролу та жирних кислот.
Екстракція ліпідів. Екстракцію ліпідів проводили за методом Bligh і Dyer [57].
Для зменшення адсорбції аніонних фосфоліпідів на білки та для більш повного
виділення цих сполук, згідно з рекомендації Palmer, використовували водну фазу
з іонами кальцію [202]. Заморожену у скрапленому азоті певну кількість тканини
розтирали у порцеляновій ступці до порошку, переносили до скляного
гомогенізатора і додавали екстрагуючу суміш – хлороформ-метанол (1:2) до
кінцевого співвідношення розчинників хлороформ-метанол-вода (1:2:0,8),
враховуючи при цьому, що 1г сирої тканини містить близько 0,8 г води. Отриману
суміш гомогенізували протягом 30 хвилин. Для розшарування системи на водну та
збагачену ліпідами хлороформну фазу додавали ще один об’єм хлороформу та 0,9 %
розчин хлористого кальцію до одержання кінцевого співвідношення розчинників -
водна фаза-хлороформ-метанол - 0,9:1:1. Для прискорення розділення фаз
гомогенат центрифугували протягом 10 хвилин при (2,0-3,0)*103 об/хв. Нижню
хлороформну фазу забирали, а до водно-метанольної додавали рівний об’єм
хлороформу для повторного екстрагування. Після центрифугування знову відбирали
хлороформний шар. Екстрагування повторювали тричі. Хлороформні фази об’єднували
та випарювали у вакуумі до невеликого об’єму. Хлороформ-ліпідні екстракти
зберігали при -18 0С.
Визначення вмісту токоферолу. Гідроліз спиртовим розчином КОН зразка
здійснювали [6] в модифікації 2Н спиртовим розчином КОН с додаванням 0,1 г
аскорбінової кислоти на водяній лазні при 75°С в колбі зі зворотнім
холодильником протягом 30 хв. До охолодженого розчину додавали дистильовану
воду та кількісно переносили в розподільчу лійку. Неомилювані речовини
екстрагували кількома порціями петролейного ефіру (фракція 40-70°). Об’єднаний
екстракт відмивали до нейтральної реакції, та видаливши рештки вологи розчинник
влучали, а неомилювані речовини попередньо розчинивши розділяли з допомогою
методів тонкошарової хроматографії, використовуючи сорбент силікагель марки лс
5/40 m (UV 254 нм). з додаванням 13% гіпсу, елюент – суміш гексан : діетиловий
ефір (70 : 30). Хроматографію проводили без доступу світла. Плями токоферолу
після вивітрювання розчинника візуалізували в ультрафіолетовому світлі
використовуючи “Хроматоскоп –М”.
Для кількісного визначення токоферол елюювали з сорбенту діетиловим ефіром,
відділяли сорбент і випаровували розчинник. Зразок розчиняли в 3,5 мл етанолу,
додавали реактив Еммері—Енгеля і вимірювали оптичну щільність на
спектрофотометрі при l = 520 нм. проти контролю, який містив спирт та всі
реактиви додані у відповідній послідовності [6]. Калібрувальний графік будували
за стандартом з концентрацією вітаміну Е в межах 5 - 30 мкг.
Хроматографічне розділення фосфоліпідів. Для розділення фосфоріпідів
використовували двовимірну мікро - тонкошарову хроматографію за методом
Svetashev i Vaskovsky [246] на силуфолових платівках розміром 7,5ґ7,5 см, які
перед використанням активували при 110 0С протягом 30-60 хвилин. Отримані
фосфоліпідні екстракти наносили у кількості 10 мкл на активовані платівки та
піддавали розподілу у тонкому шарі сорбенту в сумішних системах розчинників у
двох напрямках. У першому напрямку застосовували систему - хлороформ
–метанол-бензол-28% аміак (65:30:10:6) відповідно, а в другому -
хлороформ-метанол-бензол-ацетон-льодова оцтова кислота-вода (70:30:10:5:4:1)
відповідно [265]. Після проходження в кожному напрямку, а особливо після
першого, платівки висушували до повного видалення залишків розчинників. Для
виявлення місць локалізації фосфоліпідів силікагель на поверхні платівок
обробляли проявником (I2 в гексані чи 10% H2SO4 в метанолі), отримані на
платівках плями фосфоліпідів кількісно збирались та використовувалась у
подальшому в кольоровій реакції для кількісного визначення.
Кількісне визначення фосфоліпідів. Вміст фосфоліпідів виражали за кількістю в
них неорганічного фосфату, який визначали спектрофотометрично при довжині хвилі
815 нм за допомогою молібдатного реагенту [246]. Калібрувальний графік
будували, використовуючи двозаміщений фосфат калію.
Визначення жирних кислот методом газорідинної хроматографії. Ліпідний екстракт
піддавали процесу метилювання для визначення вмісту жирних кислот.
Використовували модифікований метод Carreau і Dubaco [71]. Для цього сухий
ліпідний екстракт розчиняли у 0,2 мл бензолу та переносили до ампули. Додавали
1 мл 3 М
- Київ+380960830922