Раздел 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследования.
В качестве модели изучения возможных вариантов иммунофизиологических реакций использовали такое мультифакториальное заболевание, как миастения, при котором происходит нарушение многих звеньев регуляции.
Материалом для исследований служили: форменные элементы и сыворотка крови больных миастенией с поражением вилочковой железы; культура клеток одноклеточной водоросли Dunaliella viridis. Обследовали пациентов с различными клиническими формами миастении, находившихся в клинике ИОНХ АМНУ в период с 1985 - 2002 г.г.. Обследуемые были разделены на 5 групп в соответствии с различными формами заболевания:
1. миастения, протекающая без поражения вилочковой железы (М);
2. локальные формы миастении;
3. миастения, протекающая на фоне гиперплазии вилочковой железы (МГ);
4. миастения, протекающая на фоне злокачественного поражения вилочковой железы - тимомы (МТ);
5. миастения, протекающая на фоне обширных опухолей средостения (ОС).
6. В отдельную, шестую, группу были объединены пациенты без нейротрансмиттерных нарушений с неоплазией вилочковой железы.
Все пациенты были классифицированы по полу и возрасту (таблица 2.1.1).
Таблица 2.1.1
Распределение пациентов по возрасту и полу
1 группа2 группа3 группа4 группа5 группа6 группаN84192701506238Распределение по полуПолмуж.жен.муж.жен.муж.жен.муж.жен.муж.жен.муж.жен.Количнство2856118901801143623392612Распределение по возрасту<40 лет1739115721343214141734?40 лет11170318468222922238ВСЕГО623
Пациенты в клинике были обследованы по стандартному протоколу, включающему клинические, биохимические, коагулологические, бактериологические исследования. Была разработана расширенная карта индивидуального обследования, включающая дополнительные данные анамнеза, объективные данные, генеалогический анализ, иммунологические, цитогенетические, ИФА и ДНК-диагностику вирусных инфекций, иммуногематологические исследования и фенотипирование субпопуляций лимфоцитов по антигенам HLA.
С диагностической целью использовали следующие методы: световая, люминесцентная и электронная микроскопия, фотометрия, ИФА - диагностика, полимеразная цепная реакция (ПЦР), РИА - диагностика.
Для оценки изменений общей реактивности организма изучали состояние клеточных и гуморальных иммунных реакций, а также факторов неспецифической резистентности организма.
В качестве клеточного биосенсора использовали водоросль Dunaliella viridis. Это одноклеточные эукариотические клетки водорослей, которые не имеют клеточной стенки и как типичные клетки животных имеют плазматическую мембрану.
2.2. Метод определения фагоцитирующей активности гранулоцитарных нейтрофилов.
Фагоцитарную активность гранулоцитарных нейтрофилов определяли в лейкоцитарной взвеси, полученной из гепаринизированной крови [88, 115]. Для исследований смешивали равные объемы лейкоцитарной взвеси и отмытой суспензии пекарских дрожжей. Полученные образцы инкубировали 60 минут при 370 С, периодически помешивая. После инкубации готовились мазки, которые окрашивали красителем Романовского. Микроскопирование проводили под иммерсионной системой. Путем подсчета процента клеток, вступивших в фагоцитоз, рассчитывали фагоцитарный индекс. Среднее число дрожжевых клеток, находящихся в нейтрофилах крови, составляло фагоцитарное число:
ФЧ = Nдр. / N фаг.,
где N др. - количество поглощенных дрожжевых клеток;
N фаг. - количество клеток, вступивших в фагоцитоз.
2.3. Метод определения активности системы комплемента.
Активность системы комплемента определяли по потреблению его компонентов на реакцию антигена с соответствующими комплемент-связывающими антителами [21, 26, 88, 142]. Для этого сыворотку крови инкубировали при 37 0С в физиологическом растворе (9% хлористый натрий) с гемолитической системой (гемолитическая сыворотка + эритроциты барана). Параллельно готовили контрольную пробу, в которую вместо сыворотки крови вносили физиологический раствор. После инкубации образцы и контрольную пробу центрифугировали при 1 000 об/мин 15 минут и отбирали надосадочную жидкость. Гемолизат приобретал окраску при добавлении 1 N раствора соляной кислоты к исследуемым образцам. Оптическую плотность образцов и контрольной пробы измеряли колориметрически на КФК-3 при длине волны ?=450 нм против холостой пробы. Активность СК определяли по соотношению оптической плотности образца и контрольной пробы, и выражали в у.ед.
2.4. Определение концентрации ЦИК в сыворотке крови.
Образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) антиген-антитело является динамичным процессом, постоянно протекающим в организме. Все экзо- и эндогенные антигены, взаимодействующие с рецепторами иммунокомпетентных клеток и вызывающие синтез антител, являются индукторами образования ЦИК. Антитела продуцируются в организме для нейтрализации и выведения антигенов, поэтому в кроветворном русле постоянно присутствует широкий спектр ЦИК с различными структурными и биологическими свойствами. Образование ЦИК - это компонент нормального иммунного ответа. У здоровых людей ЦИК в незначительных количествах всегда присутствуют в крови.
2.4.1. Метод определения концентрации ЦИК.
Содержание ЦИК в сыворотке крови оценивали спектрофотометрически после инкубации образцов в боратном буфере и полиэтиленгликоле при комнатной температуре. При инкубации происходила преципитация ЦИК на ПЭГ, что сказывалось на изменении оптической плотности образцов. Измерение оптической плотности проводилось спектрофотометрически на СФ-46 (Россия, Ломо) при длине волны ??= 450 нм против боратного буфера [44].
Антигены (АГ) и антитела (АТ), входящие в состав циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), существенно отличаются по валентности, размеру, заряду, распределению детерминант и др. Такое разнообразие свойств антигенов и антител и их соотношений приводит к формированию иммунны