РОЗДІЛ 2
ОБ`ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об`єкти досліджень
Об'єктами досліджень слугували культури стрептоміцетів з колекції відділу загальної та грунтової мікробіології ІМВ НАНУ та свіжовиділені (з різних грунтів Украіни) моноізоляти, вітчизняний штам Streptomyces avermitilis IMV Ac 2161 далі S. avermitilis 2161.
В якості об'єкту досліджень використовували також напівпродукт антипаразитарних препаратів (НАП), який виробляє ВАТ "Біоветфарм" (м.Новоград-Волинський).
В роботі використовувався топінамбур сорту "Радість", вирощений у Київській області. Коренеплоди збирали в період з 15.10 по 15.11 та зберігали при температурі 5-7°С. Якість коренеплодів топінамбура характеризували такими показниками:
- вміст сухих речовин - 20-25%;
- вміст високомолекулярних фруктозанів - 68-80% від загальної кількості вуглеводів земляної груші.
В якості об`єктів досліджень застосовували виготовлені нами екстракти з коренеплодів топінамбура (ЕКТ), а також гідролізати екстрактів з коренеплодів топінамбура (ГТ), приготування яких здійснювалось за допомогою фізичних та хімічних методів з використанням такого обладнання:
- мікрохвильової напівпромислової установки "Артеміда" з частотою хвиль 2450 МГц, потужністю 2 кВт, з можливістю здійснення додаткового конвективного теплообміну;
- ультразвукової установки "Медітон" з частотою хвиль 44 кГц, потужністю 20 Вт та з максимальною інтенсивністю випромінювання 2,5Вт/см2;
- ультразвукового диспергатора УЗДА з частотою хвиль 22 кГц та з максимальною інтенсивністю 1,2 Вт/см2;
- електроактиватора ящикового типу (ЕА) з перфорованими електродами та із склеєною діафрагмою з тканини "бельтінг". Катод в електроактиваторі виготовлений з нержавіючої сталі Х11849Т, а анод, з метою уникнення переходу сторонніх елементів в екстракти, виготовлений з оксиднорутенієво-титанового матеріалу.
Об`єктами досліджень були також культури продуцентів авермектинів та хлортетрацикліну: Streptomyces avermitilis штамів ВКМ Ас 1301, ВНИИСХМ-51 та -54 і Actinomyces aureofaciens ТБ-619 та їх поживні середовища, склад яких приведений у таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Склад основних поживних середовищ для культивування продуцентів авермектинів та хлортетрацикліну
Компоненти живильних середовищ, %Streptomyces avermitilisActinomyces aureofaciensСередовище для вегетативно-посівного матеріалу (ВПМ):Середовище для ВПМ:Лактоза2,0-4,0Борошно кукурудзяне5,0-6,0Кукурудзяний екстракт1,0-1,5Кукурудзяний екстракт5,0-6,0Білково-вітамінний концентрат (БВК)0,4-0,6Жир кашалотовий0,9-1,0Водопровідна водадо 100Водопровідна водадо 100Ферментаційне середовище:Ферментаційне середовище:Глюкоза6,0-7,0Борошно кукурудзяне7,0-8,0Кукурудзяний екстракт0,3-0,6Кукурудзяний екстракт0,8-0,9Соєве борошно0,9-1,2NH4NO30,5-0,6БВК0,6-1,2NH4Cl0,3-0,4Водопровідна водадо 100(NH4)2HPO40,020-0,025 Крейда0,7-0,8 CoCl20,0015-0,0016 Роданістий бензіл - 160 мг/100см3 олії /задається 1см3/1дм3 середовища/
Водопровідна вода до 100
У якості добавок до ферментаційних середовищ Str. avermitilis та Act. aureofaciens використовували виготовлені нами екстракти та гідролізати коренеплодів топінамбура та його вегетативних частин.
2.2. Методи досліджень
2.2.1. Фізико-хімічні методи досліджень
1. Визначення вологи сировини здійснювали методом висушування наважки до постійної маси при температурі 105°С в сушильній камері за класичною методикою (ГОСТ 9793-73).
2. Концентрацію сухих речовин у досліджуваних середовищах визначали на рефрактометрі РЛ-2 [305].
3. Вміст високо - та низькомолекулярних фруктозанів топінамбура визначали по методиці В.Н.Хрустальової, заснованій на колориметричній реакції фруктози з фосфорно-молібденовою кислотою [306, 307].
4. Екстракцію сухих речовин коренеплодів топінамбура проводили згідно із запропонованими в літературі технологічними режимами: t=70-80°С, ?=35-45 хв, гідромодуль 1:1-1:2 [308, 150].
5. Визначення кислотності середовищ проводили на рН-метрі ЛПУ-01 [305].
6. Гідроліз екстрактів з коренеплодів топінамбура здійснювали кислотним способом з використанням сірчаної кислоти у кількості 0,2-0,5 об. % у середовищі під дією різних фізичних факторів:
а) контактного нагріву на водяній бані при температурі t=45-100°С на протязі 15-60 хв;
б) під впливом мікрохвильової енергії з частотою хвиль 2450 МГц, потужністю 1,5-2,0 кВт при температурі середовищ t=45-100°С та тривалості їх обробки 15-60 хв;
в) під дією ультразвукових хвиль з частотою 22-44 кГц та інтенсивностю випромінювання 0,8-2,5Вт/см2. Обробку середовищ здійснювали на протязі 2-15 хв при температурі 30-80°С;
г) гідроліз ЕКТ проводили також за допомогою процесу електроактивування при густині струму в електроактиваторі 140-160 А/м2 на протязі 10-60 хв і температурі середовищ 30-55°С.
7. Вміст редукуючих речовин у досліджуваних середовищах визначали методом Сампера у модифікації ВНДІСПа з 3,5-динітросаліциловою кислотою на спектрофотометрі СФ-26 [309, 310].
8. Масову частку амінного азота в середовищах визначали за методом мідних сполук [311]. При цьому проводили попереднє розбавлення проб екстрактів та гідролізатів дистильованою водою у співвідношенні 1:9 для поліпшення умов титрування.
9. Вільні амінокислоти в екстракті, гідролізатах топінамбура та культуральній рідині S. avermitilis визначали на амінокислотному аналізаторі АКА-339 (ГОСТ 8.010-90).
10. Вміст органічних кислот в екстрактах та гідролізатах визначали за допомогою високоефективного рідинного хроматографа високого тиску чеської фірми "Laboratorni Pristroje" [312].
11. Визначення вологості біомаси продуцентів біологічно активних речовин проводили методом висушування до постійної маси [180]. Перед визначенням біомасу продуцента звільняли від культуральної рідини центрифугуванням при n=3000 хв-1. Після чого її декільк