РОЗДІЛ 2
КЛІНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ВАГІТНИХ З ЗАЛІЗОДЕФІЦИТНОЮ
ГЕСТАЦІЙНОЮ АНЕМІЄЮ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Комплекс використаних методик при обстеженні вагітних з гестаційною
анемією та їх новонароджених
З метою вияснення певних патогенетичних механізмів розвитку та перебігу
гестаційної анемії, порушення функції печінки і імунологічних зрушень, які
виникають в організмі матері і плода, ми поряд з комплексним клінічним
обстеженням проводили інструментальні, біохімічні та імунологічні дослідження.
Детекцію кількісного вивчення Ig G, Ig A, Ig M в сироватці крові біохімічним
методом за Mancini et al [466]. Принцип методу полягає у фракціюванні білків
сироватки крові органічними розчинниками і буферними розчинами. Утворені
білково-буферні комплекси змінюють фотоелектричну густину середовища, завдяки
чому на фотоелектрокалориметрі виводяться показники, що характеризували вміст
імуноглобулінів. Вивчення кількісного вмісту Ig G, Ig A, Ig M за методом
G.Manchini [466], дає тільки орієнтовну оцінку стану гуморального імунітету при
різних патологічних процесах, оскільки градієнт величин різних класів
імуноглобулінів у здорових вагітних і при патологічних станах є досить широкий
і зміни нерідко знаходяться в межах фізіологічних показників. Виходячи з цього,
поряд з вивченням загальної кількості Ig G, Ig A, Ig M в сироватці крові, ми
визначали кількісні і якісні зміни різних класів імуноглобулінів в фракціях
сироваткового білка диск-електрофореграми в поліакриламідному гелі за методикою
М.Д.Василюка [466, 467].
Методика кількісного і якісного вивчення Ig G, Ig A, Ig M в фракціях
сироваткового білка диск-електрофореграми в поліакриламідному гелі. Після
проведення диск-електрофорезу в 7,5 % поліакриламідному гелі чотирьох проб
сироваткового білка одну гелеву колонку фарбували 0,1 % розчином амідочорного
10 В і після промивки встановлювали на шкалу фореграмометра для визначення
локалізації і наявності фракцій в зоні повільних посттрансферинів ДЕФ в ПААГ.
Враховуючи ту особливість, що всі зразки розігнаного білка в гелевих колонках є
ідентичними, встановлювали незафарбовані ДЕФ на місце зафарбованої та за
допомогою ножа-приставки до фореграмометра розрізали на окремі диски. Диски
окремих фракцій сироватки крові зони повільних посттрансферинів розміщували на
чашки Петрі в строгій послідовності на віддалі 15-20 мм між ними, заливали
агаром “Діфко” з диспергованою моноспецифічною антисироваткою Ig G, в другу
чашку – Ig A, в третю – Ig M. Після витримки всіх проб на протязі 48-72 годин у
вологій камері при кімнатній температурі проводили фіксацію в трихлороцтовій
кислоті і промивку в 7 % розчині оцтової кислоти. В агарі навколо дисків
фракцій, де знаходяться імуноглобуліни, виникають кільця імунодифузії різних
діаметрів, які мають пряму залежність від кількості імуноглобулінів в даній
фракції. Складали пропорцію:
,
де IgФ – кількість імуноглобулінів в окремій фракції, г/л;
IgЗ – загальна кількість імуноглобулінів в сироватці крові, г/л;
ДФ2 – квадрат діаметру кільця імунодифузії цієї фракції, мм2;
?Д2 – сума квадратів кілець імунодифузії всіх фракцій, що містять даний клас
імуноглобуліну, в мм2.
Для імунофенотипування субпопуляцій Т- і В-лімфоцитів [CD3+, CD4+, CD8+, CD24+
(ІПО 24+), CD56+ (NK), CD150+ (ІПО 3+), ІПО47+ (HLA-DR+)] з використанням
моноклональних антитіл, лімфоцити виділяли з периферійної крові за методом
Л.Б.Хейфец, В.Ф.Абалкіна (1973) [140, 468]. Шприцом, промитим гепарином 1:5000,
брали у хворої з ліктьової вени кров у кількості 5-7 мл, розводили вдвічі
ізотонічним розчином натрію хлориду і по стінці пробірки нашаровували 5 мл
розведеної крові на 3 мл суміші фікол-верографіну (“Рhаrmасіа”, Швеція)
(густина 1,076-1,078 г/см3). Суміш центрифугували протягом 30 хвилин при 400 g,
потім пастерівською піпеткою відсмоктували інтерфазний шар, який складався з
лімфоцитів. Отримані лімфоцити відмивали охолодженим (4 °С) забуференим
фосфатами (рН=7,2) фізіологічним розчином (ЗФР) шляхом центрифугування при 400
g тричі по 20, 10 і 10 хвилин відповідно. Після останнього центрифугування до
осаду додавали невелику кількість ЗФР, ресуспензували та за допомогою
трипанового синього проводили підрахунок кількості живих та мертвих клітин у
камері Горяєва. Готували робочу концентрацію 4 · 109 клітин в 1 мл ЗФР. Реакцію
виявлення антигенів клітин проводили за модифікованою методикою Е.Reinherz та
спів. на предметних скельцях, попередньо сумлінно відмитих та знежирених у
суміші Нікифорова. Контури нанесення клітин обмежували плівкою Раrаfіlm М, яку
розплавляли на скельцях після нанесення отворів (діаметр – 5 мм). У лунки
заливали 0,01 % р-н полі-L-лізину (молекулярна маса 40-80 тисяч дальтон) в ЗФР,
інкубували 45-60 хв при 37 °С, промивали в ЗФР. На скло з шаром полі-L-лізину
наносили 0,05 мл виготовленої суспензії лімфоцитів. Клітини осаджувались на
склі у вологій камері протягом 20 хв при 37 °С, потім 30-40 хв при 4 °С. Після
дворазового промивання скелець круговими рухами в ЗФР в лунки наносили 20 мкл
моноклонових антитіл СD3, СD4, СD8, СD24, СD56 (“Sіgmа”, США), ІПО-З, ІПО-4,
ІПО-47 (Інститут онкології та патології ім. А.Кавецького АМН України),
інкубували при 4 °С протягом 30 хв, промивали триразово в ЗФР. У лунки на 30 хв
при 4 °С наносили 50 мкл кон’югованих із ФІТЦ F(аb)2 фрагментів кролячої
сироватки до імуноглобулінів миші (‘’Sіgmа’’, США). Потім препарат тричі
послідовно промивали в охолодженому (4 °С) ЗФР, висушували на повітрі, знімали
плівку Раrаfіlm М, наносили краплю 50 % гліцерину, накривали покривним
скельцем, краї якого запаювали розплавленим парафіном. Препарат зберігали до 2
діб пр
- Київ+380960830922