РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали
Дослідження проведені на еритроцитах крові дорослих здорових донорів і людей з
ендокринною патологією (гіпо- та гіпертиреоз), яку отримували на Харківській
обласній станції переливання крові і в клініці при Інституті проблем
ендокринної патології ім. В.Я.Данилевського АМНУ, а також на еритроцитах
пуповинної крові людини, яку одержували методом, описаним в [181] у пологових
відділеннях Харківських клінік. В якості консерванту в усіх випадках
використовували консервуючий розчин “Глюгіцир”.
Проникність мембран еритроцитів людини визначали для речовин низки діолів (1,2-
та 1,3-пропандіол; 1,2-, 1,3-, 1,4- та 2,3-бутандіол), етиленгліколю, ді- та
триетиленгліколю, диметилсульфоксиду (ДМСО), низки амідів (ацетамід,
метилацетамід, диметилформамід та диметилацетамід), гліцерину та низки його
моноалкілових ефірів: (1?монометиловий ефір гліцерину (1?ММЕГ), 1?моноетиловий
ефір гліцерину (1?МЕЕГ), 1?моноізопропіловий ефір гліцерину (1?МІПЕГ)).
Моноалкілові ефіри гліцерину були синтезовані та очищені фракційною перегонкою
у вакуумі у відділі кріопротекторів ІПКіК НАНУ. Чистоту речовин контролювали
методом газорідинної хроматографії. Будова похідних гліцерину підтверджувалась
порівнянням розрахованих та експериментальних значень молекулярної рефракції, а
також методом ІК?спектроскопії [182]. Всі інші речовини були марки “х.ч.” або
“ч.д.а.”, додатково очищені у відділі кріопротекторів ІПКіК НАНУ. Очищення
діолів здійснювали шляхом подвійної вакуумної перегонки (тиск не більше
2 мм рт.ст.) після попередньої абсорбції на активованому окисі алюмінію.
Гліцерин очищували однократною перегонкою з преабсорбцією на активованому
вугіллі. Проникність визначали для 1 М концентрацій речовин за температури 20оС
(якщо не зазначено інше).
В якості блокатора водних білкових каналів використовували сульфгідрильний
реагент p-Chloromercuribenzenesulfonic Acid Monosodium Salt фірми SIGMA
(pCMBS). Обробку еритроцитів блокатором проводили за рекомендаціями, наданими в
роботі [87], тобто інкубацією з 2 мМ pCMBS впродовж 1 години при 22оС. Після
інкубації еритроцити відмивали фосфатним буфером рН 7,4.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Теоретичні методи. В теоретичній частині роботи використовували
фундаментальні принципи термодинаміки необоротних процесів [183,184], теорії
пружності тонких оболонок при кінцевих деформаціях [185], теорії випадкових
процесів [186] і гідродинаміки (за малих чисел Рейнольдса) [187], метод
асимптотичного інтегрування системи сингулярних рівнянь з малим параметром
[188], теорію Мі розсіювання світла сферичними однорідними частинками в
наближенні аномальної дифракції [189,190].
Статистичну обробку результатів досліджень проводили за методом
Фішера-Стьюдента з використанням t-критерію та кореляційного аналізу [191].
2.2.2. Теоретичні основи використання методу малокутового розсіювання світла.
Основні експериментальні результати були отримані методом малокутового
розсіювання світла суспензією еритроцитів [192,193]. Принцип реєстрації світла,
розсіяного на різні кути, давно використовується для визначення розмірів клітин
[194]. Теоретичний аналіз процесів поглинання і розсіювання електромагнітних
хвиль малими частинками поданий в роботах [189,190]. Розсіювання світла
біологічними суспензіями визначається неоднорідностями, якими є вміщені в
рідину клітини і макромолекули. Взаємні відстані, які втричі перевищують радіус
частинок, є достатніми для того, щоб вважати їх незалежними розсіювачами. Іншою
необхідною умовою, котра значно спрощує аналіз та інтерпретацію результатів
вимірювань за розсіюванням світла, є можливість нехтування багаторазовим
розсіюванням. Пряма пропорційність між інтенсивністю розсіювання і кількістю
часток має місце лише за умови, якщо випромінювання, що падає на частинку, не
залежить від її положення в шарі. Тобто необхідно, щоб оптична товщина об’єкта
що вивчається, була малою. З теоретичних міркувань також випливає, що
вимірювання за принципом розсіювання світла є найбільш ефективними в разі, коли
розмір частинок має порядок довжини хвилі. З урахуванням того, що клітини
зважені у водному розчині в невеликій кількості, а коефіцієнт заломлення води
по відношенню до вакууму становить 1,33, отримуємо, що довжина хвилі
безпосередньо в клітинній суспензії буде становити (1/1,33) мкм. Якщо розмір
частинок приблизно співпадає з довжиною падаючої хвилі, то головний внесок в
екстинцію надає розсіювання, а не поглинання.
У відповідності до строгої теорії розсіювання світла сферичними частинками
маємо, що інтенсивність розсіяного під малим кутом q світла сферичною частинкою
радіуса R, яка освітлюється паралельним пучком з інтенсивністю Io, визначається
виразом [189]:
J(q)=(2p/l)2(R4/r2)F(r,z) (2.1)
де
r = 2x(nin/nout – 1), z = xq, x = 2pRnout/l (2.2)
l - довжина хвилі світла, що падає на розчин з показником заломлення nout, в
якому вміщена сфера, r – відстань від сфери, що розсіює світло, до
фотоприймача.
Оскільки, як показано в нашій роботі, в процесі гіпотонічного гемолізу,
починаючи з моменту, коли об’єм клітини перевищує значення So3/2/6Цp, еритроцит
представляє собою пульсуючу в часі сферу, об’ємний вміст гемоглобіну в якій
стрибкоподібно змінюється в моменти, коли в мембрані еритроцита утворюється
чергова макроскопічна пора, і насамкінець падає до нуля, формулу (2.1) можна
використовувати для розрахунку інтенсивності світла, що розсіюється сфероцитом,
як функції часу в перебігу цього процесу. При цьому, зазвичай, вважається
[195], що внеском мембрани в розсіювання можна знехтувати і ро
- Київ+380960830922