РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Отримання та характеристика антитіл проти фрагментів a і b субодиниць нАХР.
Для синтезу було відібрано пептиди, що відповідали послідовностям фрагментів
субодиниць нАХР щура, представлених в таблиці 2.1. Синтез проводили класичним
твердофазним методом на фенилацетамідометильних носіях з використанням
стратегії Вос і напівпостійного бензилового захисту. Захист Вос було знято
сумішшю трифтороцтової кислоти та діхлорометану у співвідношенні 1:1, а
відщеплення пептиду від носія та залишку бензилу проводили сумішшю фторова
кислота/диметилсульфід/анізол у співвідношенні 10:1:1 при 0о С. Пептиди потому
очищали методом рідинної хроматографії високого тиску в градієнті ацетонітрилу;
їх чистоту характеризували методами ядерного магнітного резонансу та
масс-спектрометрії. Синтез фрагментів альфа-субодиниць було проведено у відділі
біохімії Еллінського Інституту Пастера (Афіни, Греція), а синтез фрагментів
бета-субодиниць – у лабораторії нейропептидних рецепторів Інституту
біоорганічної хімії ім. Шемякіна-Овчіннікова (Москва, Росія). Похідні пептидів
a3 (181-192) та a5 (180-191), де амінокислотні залишки почергово замінювались
на залишки аланіну, було синтезовано у відділі хімії Університету Іоаніни
(Іоаніна, Греція).
Будову пептидів за профілями гідрофільності оцінювали з використанням
комп’ютерної програми EPIPLOT.
Таблиця 2.1 Амінокислотні послідовності використаних синтетичних пептидів.
a3 (181-192)
APGYKHEIKYNC
a4 (181-192)
AVGTYNTRKYDC
a5 (180-191)
AMGSKGNRTDSC
a7 (179-190)
b2 (190-200)
b4 (189-199)
IPGKRNEKFYEC
GRRNENPDDST
GRRTVNPQDPS
Пептиди приєднували до двох білкових носіїв: гемоцианіну равлика (ГР) та
бичачого сироваткового альбуміну (БСА). Використовували два методи кон’югації:
за допомогою N-сукциніміділ 3-(2-піридилдітіо) пропіонату (СПДП) та глютарового
альдегіду (ГА).
Приєднання за допомогою СПДП проводили за методом Карлссона [255]. По 3 мг ГР
або БСА („Sigma”, США) розчиняли в 6 мл 0,1 М натрій-фосфатного буфера рН 7,5 з
0,1 М NaCl. Потому додавали 3 мг СПДП (‘Pharmacia Fine Chemicals”, Швеція),
розчиненого в 240 мкл етанолу, і перемішували протягом 30 хв. На магнітній
мішалці за кімнатної температури. Низькомолекулярні продукти реакції видаляли
діалізом проти буфера, після чого додавали 1,2 мг пептиду в 0,1 мл буфера і
перемішували 20 хв. за кімнатної температури. Молярну концентрацію приєднаного
пептиду оцінювали спектрофотометрично, вимірюючи відповідну концентрацію
звільненого піридин-2-тіона (молярна екстинкція за довжини хвилі 433 нм = 8,08
х 103). Активовані групи носія, що залишилися, блокували 10-кратним молярним
надлишком вільного цистеїну (“Merck”, Німеччина) по відношенню до концентрації
пептиду. Отримані кон’югати (S-кон’югати) діалізували проти забуференого
фізрозчину (ЗФР: 0,15 М NaCl, 0,01 M KH2PO4, pH 7,2) і кінцеву концентрацію
білка вимірювали за методом Бредфорда [256].
Для приєднання за допомогою ГА 2 мг білка змішували з 1 мг пептиду в 1,4 мл ЗФР
і по краплям, протягом 5 хв. за постійного перемішування при кімнатній
температурі додавали 0,125 мл 0,2% ГА (“Merck”, Німеччина). Потому суміш
перемішували іще 30 хв. і додавали 0,15 мл 1М гліцину в ЗФР для блокування
активних груп ГА, що залишилися. Отримані кон’югати (N-кон’югати) діалізували
проти ЗФР. Амінокислотний склад отриманих кон’югатів пептид-БСА оцінювали
прямим аналізом за одноколоночним методом в літій-цитратному буфері за
допомогою амінокислотного аналізатора Т-339 (Чехія). Аналіз проводили в групі
хроматографії Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна.
Кон’югати пептидів з ГР використовували для імунізації тварин, а кон’югати з
БСА – для аналіза імунних сироваток і антитіл.
Чотири групи по 5 мишей лінії BALB/c, самок, віком 2 місяці, імунізували
внутрішньочеревно N- або S-кон’югатами пептид-ГР: по 50 мкг кон’югату в 0,25 мл
емульсії з повним ад’ювантом Фрейнда. Через три тижні і далі кожен місяць
протягом 3-5 місяців імунізацію повторювали такою ж дозою антигену в неповному
ад’юванті Фрейнда. Кров (50 мкл) брали з хвостової вени через тиждень після
другої та наступних імунізацій.
Шість кролів віком 10-12 місяців імунізували по 0,5 мг N-кон’югатів пептид-ГР в
повному ад’юванті Фрейнда. Імунізації проводили підшкірно в 6-8 точок спини та
в шкіру між пальцями задніх лап. Через три тижні проводили повторну імунізацію
підшкірно в 6-8 точок спини; антиген був емульгований в неповному ад’юванті
Фрейнда. Наступні імунізації проводили кожний місяць без ад’юванта у вушну вену
(0,25 мг кон’югата в 0,1 мл ЗФР). Кров брали з вушної вени через 10 днів після
першої імунізації та через 8 днів після повторних імунізацій.
Імунні сироватки збирали після центрифугування крові, що згорнулася, і
зберігали аліквотами при -20оС.
Для одержання гібридом клітини селезінки імунізованих мишей, виділені звичайним
способом, зливали з клітинами мишачої гібридоми SP-2/0 за допомогою
поліетиленгліколю [257]. Гібридні клітини вирощували в культуральному
середовищі RPMI 1640, доповненому 20 мМ HEPES, 20 мМ L-глютаміном, 5х10-5 М
b-меркаптоетанолом, 50 мкг/мл пірувату натрія, 41 мкг/л інсуліну, 40 мкг/мл
гентаміцину та 20% ембріональної сироватки теляти. Селекцію гібридизованих
клітин проводили стандартною сумішшю гіпоксантин/аміноптерин/тимідин. Клони
потрібної специфічності відбирали за даними імуноферментного аналізу і двічі
реклонували методом лімітуючих розведень.
Очищення антитіл із імунних сироваток або культурального середовища гібридом
проводили методом афінної хроматографії на антигенних пептидах, імобілізованих
на нерозчинних носіях.
1,2 г АН-Сефарози 4В (“Pharmacia Fine Chemica
- Київ+380960830922