РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
У дослідженнях використано 114 білих щурів-самців однакового віку та маси. Тварини були розділені на три групи. Перша група включала 23 інтактні щурі, які знаходились у звичайних умовах віварію. Друга група (24 тварини) - це щурі з експериментальною артеріальною гіпертензією. Третю групу складали тварини (67 щурів) з експериментальною гіпертензією, яким внутрішньошлунково вводили щоденно казеїнові пептидні препарати протягом 14 днів після операції, коли у тварин розвивалась стійка гіпертензія. Всі оперативні втручання у експериментальних тварин проводились із дотриманням правил асептики і антисептики за умов тіопенталового наркозу. Через один день після завершення введення казеїнових пептидних препаратів у всіх тварин (включаючи першу і другу групи) вимірювали артеріальний тиск крові за допомогою плетизмометричного апарату.
Для виконання поставлених в роботі завдань, що випливали із мети дисертаційної роботи, було використано 52 штами молочнокислих бактерій, зокрема мезофільні молочнокислі лактококи, які відносяться до різновидностей Lcc. lactis subsp. lactis (19 штамів), Lcc. lactis subsp. cremoris (14 штамів), Lcc. lactis biovar. diacetylactis (17 штамів) та 2 штами термофільних стрептококів Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. Штами лактококів були отримані з лабораторії мікробіології Литовського харчового інституту (м. Каунас), лабораторії біотехнології Технологічного інституту м'яса і молока УААН (м. Київ), центральної лабораторії мікробіології Всесоюзного науково-дослідного Інституту молочної промисловості (м. Москва), лабораторії фізіології мікроорганізмів інституту мікробіології НАН Білорусі (м. Мінськ) та лабораторії мікробіології Білоруського науково-дослідного конструкторсько-технологічного інституту м'ясної і молочної промисловості (м. Мінськ).
При пересіванні штамів лактококів у якості поживного середовища використовували свіже стерилізоване знежирене молоко. Лактококи зберігали при температурі 40С. Пересіви штамів проводили через кожні 20 днів. При довготривалому зберіганні штами ліофілізували у спеціальних скляних ампулах. Для зручності в роботі всі штами були перейменовані (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Використані в роботі штами молочнокислих бактерій1
Laсtococсus lactis subsp. lactisLaсtococсus lactis subsp. cremorisLaсtococсus lactis biovar. diacetylаctisОригінальна назва штамуУмовна назваОригінальна назва штамуУмовна назваОригінальна назва штамуУмовна назваU1403Rl1T18c1K104 IId1117 28IIl288220c2K1053Id2Z 252l3R211c3K109 4d3b12l47-31c42/1d41444l525-57c5M-73 9d577l6a2IVc6Дябл 8d67323l74061c7К105 ІІd767110l82/54c8Дябл 10gd840147l92615c9Д13/3 Id9C140 5l10T17c10K106 3d10574l1196 82c11146d11814l1296 83c12878d1229l13446c1321яблd132245l14934лc14145d141404l15841d151252l16137d161554l17142d172086l18121l20
Примітка. Назви термофільних стрептококів змінювали наступним чином (штами 91 > st1; штам 142 > st2).
Всі використані в дослідженнях реактиви, крім нижче описаних, були фірми "Реахим" ("ХЧ" або ОСЧ").
2.2. Методи ідентифікації казеїнових фракцій
2.2.1. Диск-електрофорез білків казеїнового комплексу. Проводили в нативних умовах анодної диск-ПААГ системи для кислих і нейтральних білків. Різні варіанти цієї системи описані раніше [10, 40]. Для виготовлення концентруючого і розділяючого гелів використовувались наступні розчини і співвідношення (об'ємні). Незначні зміни у порівнянні з методикою Б. Девіса [36] внесені у склад концентруючого гелю.
Складові частини розділяючого гелю (рН 8,9):
1 н HCl - 24 мл
Тріс - 18,3 г
ТЕМЕД - 0,115 млАкриламід (АА) - 15 г
Метиленбісакриламід (МБА) - 0,4 гПерсульфат амонію (ПСА) - 0,065 гдо 50 мл Н2Одо 50 мл Н2Одо 50 мл Н2О1 частина2 частини5 частин
Складові частини концентруючого гелю (рН 6,9):
1 н HCl - 24 мл
Тріс - 2,99 г
ТЕМЕД - 0,23 мл АА - 5 г
МБА - 1,25 гСахароза - 20 гПСА - 0,03 гдо 50 мл Н2Одо 50 мл Н2Одо 50 мл Н2Одо 20 мл Н2О1 частина2 частини4 частин1 частина
Електродний буфер (рН 8,3) включав:
Тріс - 6 г
Гліцин - 28,9 гдо 100 мл Н2О
Електрофоретичне розділення зразків проводили в трубочках приладу фірми "Reanal" (Угорщина).
2.2.2. Електрофорез казеїнів в присутності додецилсульфату натрію. Проводили за методом, запропонованим Н.С. Шелудько [76]. Склад гелю і електродного буферу:
Гель
0,77 М борна кислота
0,2 М тріс
7,5 % АА
0,188 % МБА
0,1 % додецисульфат натрію (ДСН)Електродний буфер
0,77 М борна кислота
0,2 М тріс
рН 7,0
Для полімеризації до 90 мл гелю додавали 10 мл 0,45 % персульфату амонію і 0,05 мл ТЕМЕД. Зразок білків для електрофоретичного аналізу мав наступний склад:
0,77 М борна кислота
0,2 М тріс
2 % ДСН
20 % сахароза
5 % ?-меркаптоетанол
1 мг/мл білків
сліди бромфенолового синьогорН 7,0 Використовувався апарат для електрофорезу в трубочках фірми "Reanal" (Угорщина).
2.2.3. Диск-електрофорез в градієнті ПААГ в присутності додецилсульфату натрію. Використовували методику, запропоновану С.Д. Казьміним і С.Д. Шербаном [23]. Електрофорез проводили в апараті з вертикальними пластинками ПААГ. Градієнт розділяючого гелю (4-20%) створювали використовуючи дві сполучені посудини однакового об'єму і мікронасос фірми LKB (Швеція). Формували градієнт з допомогою гліцерину. Для цього до складу більш концентрованого розчину мономеру водили 20 об. % гліцерину, а в склад менш концентрованого - 5 об. %. Буфер і вихідні розчини для розділяючого гелю готували наступним чином:
Буфер для гелів
Тріс - 2,0 г
Сечовина - 24,0 г
ДСН - 100 мл
HCl до рН 8,3Гель (20 %)
АА - 10,0 г
МБА - 0,150 г
Гліцерин - 10 млГель (4 %)
АА - 2,0 г
МБА - 0,125 г
Гліцерин - 2,5 мл Н2О до 100 мл Буфер до 50