РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконана на кафедрі паразитології та іхтіопатології Львівського
національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З.
Гжицького, в ставкових господарствах Західного регіону України – у рибдільницях
“Горбок” і “Пістрялово” ВАТ “Закарпатський рибкомбінат” (Закарпаття), в
рибгоспі “Рудники” та рибдільниці “Держів” (Прикарпаття), в рибгоспі “Красне”
та рибдільниці “Сторонибаби” (Західний Лісостеп) ВАТ “Львівський рибкомбінат”,
а також у рибгоспі “Маневичі”, рибдільниці “Костюхнівка” (Західне Полісся) ВАТ
“Волинський рибкомбінат” в період від 2000 по 2007 рік.
Метою першого етапу дисертаційної роботи було дослідження впливу інвазії
Bothriocephalus acheilognathi різної інтенсивності на фізіологічний стан
цьоголіток коропа. Для цього було сформовано три групи цьоголіток коропа із
вирощувальних ставів. Риби 1-ї групи, вільні від кишкових цестод
(Bothriocephalus acheilognathi), правили за контроль. Риби 2-ї групи були
слабоінвазовані стрічковими гельмінтами (інтенсивність інвазії – 1–3
гельмінти), а риби 3-ї групи – сильноінвазовані (інтенсивність інвазії – 4
гельмінти і більше). Жива маса коропа коливалась від 14,5 до 20,5 г. Для
досліджень брали стінку кишечнику, гепатопанкреас і зразки м’язів передньої
апікальної частини спини, які одержували відразу після декапітації риб після їх
вилову зі ставів. Зразки тканин заморожували в рідкому азоті. Використовуючи
методи клінічної біохімії, визначали вміст показників у середніх зразках
тканин, у кожний із яких входила наважка тканин від 6-ти риб. У дослідженнях
використано чотири середніх зразки тканин риб кожної групи.
Визначення вмісту загальних ліпідів у біологічних матеріалах виконували за
методом Фолча [399] сумішшю хлороформу з метанолом у співвідношенні 2:1.
Принцип методу полягає в руйнуванні ліпідно-білкових зв’язків полярним
розчинником (у цьому випадку метанолом), що полегшує подальше екстрагування
ліпідів неполярним розчинником (хлороформом). Очищення отриманого ліпідного
екстракту від неліпідних компонентів здійснювали водним 0,74%-ним розчином KCl.
Після розділення двох фаз: верхню – воднометанольну фазу – відбирали
водоструминною помпою, а нижню фазу відганяли від хлороформу. За різницею мас
колби з ліпідами і порожньою визначали масу загальних ліпідів. У подальшому
ліпіди використовували для визначення їх класів з допомогою тонкошарової
хроматографії, а також для визначення жирнокислотного складу на газорідинному
хроматографі.
Визначення вмісту окремих класів ліпідів у тканинах здійснювали методом
тонкошарової хроматографії на силікагелі [109]. Скляні пластинки 9 х 10 см
покривали шаром водної суспензії, яка складалася з силікагелю (4,32 г), гіпсу
(0,36 г) і дистильованої води (11,0 мл). Пластинки висушували при кімнатній
температурі на горизонтальній поверхні. Пластинки активували в сушильній шафі
при 105–110 оС протягом години. 1 мг ліпідів наносили на пластинку і розділяли
їх на класи в системі розчинників гексан-діетиловий ефір – льодова оцтова
кислота (70:30:1) [109], з подальшим виявленням окремих класів шляхом обробки
пластинок в парах йоду [297]. Кількісне визначення ліпідних класів
(фосфоліпіди, ди- і триацилгліцероли, вільні жирні кислоти, вільний і
етирифікований холестерол, визначали біхроматним методом, шляхом визначення
інтенсивності забарвлення на спектрофотометрі при довжині хвилі 490 нм [8].
Аналіз жирних кислот виконували за допомогою газорідинного хроматографа (ГРХ)
«Хром-4» (Чехія). В основі методу ГРХ лежать фізико-хімічні властивості летких
сполук розділятися між двома фазами: нерухомою рідинною і рухомою газоподібною.
Для цього методу потрібне перетворення жирнокислотних радикалів на метилові
ефіри. Синтез метилових ефірів жирних кислот отримували шляхом прямої
переетерифікації ліпідів у метанолі. Для цього ліпідний екстракт у кількості
10–20 мг переносили в скляні ампули, відганяли екстракційну суміш, додавали до
залишку 2 мл бензолу і 2 мл 5–7% H2SO4 в абсолютному метанолі. Ампули запаювали
і вміщували в термостат при температурі 72 оС на 48 год. Метилові ефіри жирних
кислот екстрагували хлороформом, після відгону якого, розчиняли їх у гексані і
розділяли на газорідинному хроматографі. Застосовували іонізаційно-полум’яний
детектор, а вихідний сигнал реєстрували самописцями. Довжина колонки – 240 см,
діаметр – 3 мм, наповнювач – поліетиленглікольсукцинат на силанізованому
хромосорбі 60–80 меш, температура випарювача – 240 оС, термостата колонок
–180оС. Як нерухому рідинну фазу Silar використовували на хромотроні N-AWHMDS
при температурі випарювання – 240 оС, термостата колонок – 200 оС. Витрати
водню – 35 мл/хв, газу-носія – азоту – 25 мл/хв, повітря – 400 мл/хв. Отримані
в процесі аналізу піки жирних кислот ідентифікували за допомогою стандартів
відомих жирних кислот за логарифмічною залежністю, наявною для гомологічних
рядів жирних кислот. Кількісний розрахунок хроматограм після ідентифікації
здійснювали методом внутрішньоклітинної нормалізації [42, 241, 272].
Визначення вмісту дієнових кон’югатів у тканинах визначали за методом И.Д.
Стальной [260]. В основі методу лежить реакція перекисного окиснення на стадії
утворення вільних радикалів у молекулах поліненасичених вищих жирних кислот, де
виникає система спарених подвійних зв’язків, які супроводжуються появою
максимуму в спектрі поглинання – л макс. = 233 нм. Концентрацію дієнових
кон’югатів у пробі визначали, використовуючи коефіцієнт молекулярної екстинції
Е = 0,22 мкМ-1 см -1 і виражали її в мікромолях на 1 г тканини.
Вміст гідропереки
- Київ+380960830922