Вы здесь

Наукове обґрунтування і удосконалення генетичних методів дослідження раннього ембріогенезу сільськогосподарських тварин

Автор: 
Ковтун Світлана Іванівна
Тип работы: 
Дис. докт. наук
Год: 
2008
Артикул:
0508U000672
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ<br /> Загальна схема досліджень наведено на рис. 2.1.<br />2.1. Формування доімплантаційних зародків великої рогатої худоби та свиней поза<br />організмом. <br />2.1.1. Відбір яєчників забитих тварин та їх доставка в лабораторію. Для<br />одержання ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) відбирали яєчники на бойні від<br />забитих гінекологічно здорових 103 корів різних порід і 123 свиней породи<br />велика біла. Яєчники корів відбирали на стадії фолікулярного росту або із<br />старим жовтим тілом. Найчастіше використовували яєчники, в яких спостерігається<br />велика кількість антральних фолікулів діаметром від 2 до 6 мм [156]. Яєчники<br />свиноматок відбирали від тварин перед досягненням статевої зрілості [274].<br />Яєчники доставляли в лабораторію в термосі при температурі +30 - +33°C протягом<br />1,5 – 2,5 годин. Після доставки в лабораторію яєчники промивали 4 рази у<br />теплому (+37-+38°C) cтерильному фосфатно-сольовому розчині Дюльбеко (PBS,<br />Sigma, D 8662) із 0,075 мг/мл канаміцин сульфату (ВАТ «Київмедпрепарат»). <br />2.1.2. Вилучення незрілих ооцитів корів та свиноматок. Видалення ОКК з<br />антральних фолікулів яєчників корів та свиней здійснювали шляхом розсічення<br />фолікулів лезом безпечної бритви в PBS із 0,075 мг/мл канаміцин cульфату. Також<br />у яєчниках свиней здійснювали вирізання окремих антральних фолікулів або групи<br />фолікулів з наступним розриванням їх скальпелем одноразового використання, або<br />застосовували метод аспірації фолікулів. Видалення ОКК, їх відбір та постановку<br />на дозрівання, запліднення і подальше культивування здійснювали у стерильних<br />умовах боксу. <br />Рис. 2.1. Загальна схема досліджень<br />Температура в боксі підтримувалася на рівні +22 - +25°С. Для культивування<br />відбирали ОКК з ооцитами корів діаметром 140 – 170 мкм. Ооцити свиней мали дещо<br />менші розміри (120 – 130 мкм) і більш темнішу ооплазму, що пов’язано з<br />наявністю великої кількості ліпідних гранул. Відбирали гамети корів та свиней,<br />які містили цільний щільний темний кумулюс, неушкоджену прозору оболонку і<br />гомогенну невакуолізовану ооплазму правильної округлої форми, без морфологічних<br />ознак просунутої атрезії. <br />2.1.3. Забезпечення умов дозрівання ооцитів in vitro. Вилучені ОКК 6-разово<br />відмивали в середовищі 199, яке містить 25 мМ буфера Hepes (Sigma, M 2520), 10<br />% сироватки крові великої рогатої худоби власного приготування і одноразово<br />промивали в середовищі для дозрівання. <br />Відбір та відмивання ОКК здійснювали на нагрівальному столику при +37°С. ОКК<br />корів культивували in vitro протягом 24 годин в пластикових чашках Петрі (по 25<br />– 30 ООК у 1мл) у середовищі для дозрівання – 199 на розчині Ерла (Sigmа, M<br />5017), яке доповнювали 20 % інактивованої нагріванням (56°C, 30 хвилин)<br />еструсної сироватки корів власного приготування, 0,068 мг/мл канаміцин<br />сульфату, 0,11 мг/мл пірувату натрію і 0,1 мг/мл глутаміну і 3 – 5 х 106 клітин<br />гранульози на мл, які вилучали із неатретичних фолікулів. <br />Ооцити свиней дозрівали in vitro протягом 46 год. в чашках Петрі по 20 шт. в 2<br />мл середовища для дозрівання як і для корів, але крім 20 % еструсної сироватки<br />корів додавали в окремих дослідах 20 % ФСТ (Sigma, F 9665). Культивування<br />проводили при +38,8єС, 5 % СО2. При дозріванні поза організмом ОКК свиней<br />ділили на три групи: <br />середовище для дозрівання – І група;<br />середовище для дозрівання з 0,1 % ВДК tєC200 або 0,1 % ВДК tєC400 – ІІ група;<br />середовище для дозрівання з 0,01 % ВДК tєC200 або 0,01 % ВДК tєC400 – ІІІ<br />група. <br />В дослідженнях був використаний високодисперсний кремнезем (ВДК) вітчизняного<br />виробництва (м. Калуш Івано-Франківської обл.) з S пит = 300 м2/г, поверхня<br />якого перед експериментом було оброблено протягом 2 годин при температурі 200єС<br />або 400єС. <br />Застосовували методику визначення концентрації клітин гранульози фолікулів<br />яєчників корів та свиноматок (Затверджено Методичною комісією Інституту<br />розведення і генетики тварин УААН) [87]. <br />Виконували підготовку до роботи камери Горяєва. <br />Заправляли камеру пробою середовища з клітинами гранульози. <br />Проводили підрахунок клітин. Заряджену камеру розміщували на столику<br />мікроскопу, виконували підрахунок клітин при збільшенні 200 – 400 раз. Клітини<br />підраховували по діагоналі в 5 великих квадратах сітки. При підрахунку до уваги<br />брали клітини, які лежали в межах квадрату. Кількість клітин в 5 великих<br />квадратах додавали. <br /> Концентрацію клітин гранульози в 1 мл підраховували за формулою:<br /> , де <br />С – концентрація клітин гранульози в 1 мл (млрд.);<br />Н – кількість клітин, підрахованих у 5-ти великих квадратах;<br />К – кількість малих квадратів, в яких підраховували клітини (80);<br />Г – глибина камери (0,1 мм);<br />400 – множник для перерахунку на квадратні міліметри;<br />1000 – множник для перерахунку на мілілітри.<br />Для виявлення хромосомних порушень протягом дозрівання ооцитів корів in vitro<br />частину гамет використовували для приготування сухоповітряних препаратів за<br />допомогою модифікованого методу Тарковського [87, 369]. <br />Ооцити переносили в 0,9%-вий гіпотонічний розчин 3-х-заміщеного цитрату натрію<br />на 10 – 15 хвилин, механічно звільняли їх від клітин кумулюсу і фіксували на<br />сухому знежиреному склі сумішшю метанол-оцтова кислота (3:1). Фарбування<br />препаратів проводили з використанням 2%-ного розчину барвника Гімза. <br />Аналіз одержаних препаратів ооцитів корів здійснювали під світловим<br />мікроскопом. Через 24 год. культивування поза організмом більша частина ооцитів<br />корів знаходиться на стадії метафази ІІ мейозу. <br />2.1.4. Підготовка сперматозоїдів до запліднення in vitro. Осіменіння дозрілих<br />in vitro яйцеклітин корів виконували з використанням заморожених у<br />необлицьованих гранулах еякульованих сперматозоїдів плідників і сперматозоїдів,<br />о</p>