Розділ 2
Матеріали та методи дослідження.
2.1. Загальна характеристика обстежених
Для досягнення поставлених завдань мікробіологічними методами обстежено 81 хворого на цукровий діабет. Їх поділено на 3 групи: першу склали хворі з різними типами цукрового діабету без синдрому діабетичної стопи (25 осіб); другу групу - хворі на цукровий діабет із синдромом діабетичної стопи І-ІІ ступеня, яким місцево використовувався А-бактерин (25 осіб), у яких забирали матеріал для досліджень при поступленні в стаціонар та через 7-10 днів після лікування із застосуванням пробіотику, третю групу - хворі на цукровий діабет із синдромом діабетичної стопи ІІІ-ІV ступеня за F.W. Wagner (1981) [68], без лікування А-бактерином і динамічного спостереження (31 хворий).
Вивчено мiкробiоценози шкiри топодемів нижніх кінцівок (тильна та підошовна поверхня стопи, ІV міжпальцевий проміжок) та вмісту виразок хворих із синдромом діабетичної стопи та їх екологiчнi параметри у осіб, що перебували на лiкуваннi в ендокринологічному відділенні Тернопільської обласної клiнiчної лiкарнi та 1-му хірургічному відділенні Тернопільської лікарні невідкладної допомоги.
2.2. Штами мiкроорганiзмiв, живильні середовища
Пiд час проведених мiкробiологiчних дослiджень шкiри видiлено 1140 штамiв аеробних мiкроорганiзмiв, якi належали до 10 родiв. У всiх видiлених культур вивчено морфологiчнi, тинкторiальнi, культуральнi, бiологiчнi та iншi властивостi (продукцiя рiзних типiв пiгментiв, каталази, оксидази, плазмокоагулази, лецитинази, фосфатази, ацетоїну, гемолiзинiв, здатнiсть вiдновлювати нiтрати в нiтрити, окислення рiзних вуглеводiв i спиртiв), чутливість до 8 антибiотикiв.
З метою дослiдження мiкробiоценозу шкiри людини застосовували виготовленi в лабораторiї твердi та рiдкi поживнi середовища [186]. Найчастiше використовували МПА з 1 % глюкози, кров`яний МПА з 5 % еритроцитiв кролика або барана для вивчення гемолiтичних властивостей, жовтково-сольовий агар Чистовича для iзоляцiї стафiлококiв, середовища Ендо для якiсного i кiлькiсного визначення ентеробактерiй, середовище Гарро - для облiку стрептококiв, фуразолiдоно-твiновий агар - для диференцiацiї та кiлькiсного облiку мiкрококiв та коринебактерiй.
2.3. Методика дослiдження мiкрофлори шкiри
З метою вичення шкiрного мiкробiоценозу (тильної та підошовної поверхні і четвертого міжпальцевого проміжку стопи) використовували метод змивiв-зiскобiв Williamson i Kligman [118] у модифiкацiї С.І. Климнюка і С.І. Ситника [121]. Дослiджувану дiлянку шкiри обмежували за допомогою скляного цилiндру площею поперечного перерiзу 2,0 см2, притиснутого до неї. У цилiндр вносили 1 мл 0,1 % розчину тритону Х-100 у фосфатному буферi з молекулярною концентрацією 0,075 моль/л і рН 7,9, а потiм за допомогою спецiального сталевого робочого елементу з насiчками проводили зiскоб мiкрофлори при помiрному натискуваннi. Рiдину вiдсмоктували в стерильнi пробiрки, додавали в цилiндри ще 1 мл свiжого стерильного буферного розчину і повторювали процедуру. Обидвi проби змiшували i готували десятиразові розведення в 0,05 % розчинi тритону Х-100 у фосфатному буферi з молекулярною концентрацією 0,075 моль/л з метою попередження агрегацiї бактерiй. Пiсля цього по 0,1 мл різних розведених проб засiвали на селективнi та неселективнi живильні середовища та iнкубували при температурi 37 ?C. Через 24-96 годин iнкубацiї пiдраховували кiлькiсть колонiй за допомогою приладу ПСК (прибор счета колоний), а результат виражали числом колонiєутворюючих одиниць (КУО) на 1 см2 площi шкiри за формулою:
Х = 20 х М х N, (2.1)
де Х - число КУО/см2,
20 - постiйний коефiцiєнт при посiвi 0,1 мл проби,
М - кiлькiсть колонiй, що виросли,
N - розведення (в 10, 100, 1000 разiв тощо).
Враховуючи, що число мiкробiв на одиницю площi може сягати десятків тисяч особин, зручнiше було використовувати десятковий логарифм цього показника - lg КУО/см2. Приймаючи до уваги, що тритон Х-100 має незначну бактерицидну дію, проби висівали на живильні середовища не пiзнiше 1 год пiсля забору матеріалу.
Даний метод надає можливiсть бiльш точно визначити рiвень бактерiйного обсiменiння, а також забезпечити краще вiдтворення результатiв. Його застосування дозволяє достовірніше визначати кiлькiсний i якісний склад мiкрофлори шкiри.
2.4. Методика дослiдження мiкрофлори вмісту виразок
Забір проб здійснювали наступним чином: з поверхні виразки стерильним ватним тампоном забирали вміст. Тампон зважували до та після забору матеріалу на торсійній вазі. Різницю ваги приймали за кількість ранового вмісту, а потім поміщали тампон у 1 мл 0,1 % розчину тритону Х-100 у фосфатному буферi з молекулярною концентрацією 0,075 моль/л і рН 7,9, старанно струшували 10-15 хвилин. Готували десятикратні розведення матеріалу, засівали на селективнi та неселективнi живильні середовища, iнкубували при оптимальнiй температурi. Через 24-96 годин iнкубацiї пiдраховували кiлькiсть колонiй за допомогою приладу ПСК, а результат виражали числом колонiєутворюючих одиниць (КУО) на 1 грам вмісту за формулою:
Х1 = 10 х М х N/m, (2.2)
де Х1 - число КУО/г,
10 - постiйний коефiцiєнт при посiвi 0,1 мл проби,
М - кiлькiсть колонiй, що виросли,
N - розведення (в 10, 100, 1000 разiв тощо),
m - маса ранового вмісту.
Оскільки, число мiкробiв на одиницю об'єму може сягати десятків тисяч, використовували десятковий логарифм цього показника - lg КУО/г.
2.5. Ідентифікація мікроорганізмів
Мiкроорганiзми iдентифiкували згiдно класифiкацiї Bergey [187], однак додатково з метою диференцiацiї різних видiв ентеробактерiй i псевдомонад використано схеми iдентифiкацiї, розроблен