РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Рослини гороху (Pisum sativum L.) вирощували у грунтовій культурі в умовах вегетаційного будиночку. Температуру та освітленість вимірювали щоденно о 12 годині дня протягом періоду від появи паростків до відбору рослин. Вимірювання проводили на рівні рослин. Для кожної партії матеріалу підраховували середні значення температури та освітленості за період вирощування. Після чого нормували на значення цих параметрів, що відповідали оптимальним для гороху, що були визначені у попередніх роботах нашого відділу [5]: t(опт)= 15?С та освітленість (Е) 150 Вт/м2 ФАР.
В дослідженнях використовували хлоропласти з зруйнованою оболонкою (тилакоїди 2 класу), оскільки вивчення вуглецевого метаболізму не входило до кола поставлених задач. Використовували середовище виділення, що містило 50 мM трицину pH 7,6, 0,4 М сахарози, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2. Для виділення хлоропластів відбирали верхні повністю сформовані листки 14-денних рослин гороху. Листки гомогенізували на гомогенізаторі MPW - 302 (Польща) в середовищі видилення 2 хвилини. Після чого гомогенат пропускали через 2 шари бязі та центрифугували на центрифузі К-13А (Німеччина) 5 хвилин зі швидкістю 400g для осадження фрагментів клітин, крохмальних зерен, тощо. Супернатант центрифугували вдруге протягом 10 хвилин зі швидкістю 1000g, отримуючи в осаді фракцію хлоропластів.
Осад ресуспендували, пропускаючи його через капрон, в 10 мМ трициновому буфері pH 7,6 з додаванням 0,1 M сахарози, 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2.
Фрагментацію тилакоїдів проводили шляхом 15-хвилинної інкубації з 0,3% дигитоніном при співвідношенні дигітонін-хлорофіл = 3:1 в 10 мМ трициновому буфері pH 7,8 з додаванням 0,1 M сахарози, 5 мМ MgCl2. Потім застосовували традиційну [4] та модифіковані схеми послідовного центрифугування для отримання фракцій ( рис. 2.1).
Осади ресуспендували у середовищі виділення. Вихід фракцій обчислювали за відношенням сумарного хлорофілу у фракції до хлорофілу аліквоти хлоропластів, яку було взято для фрагментації. В наших дослідах сума виходів фракцій складала від 88 до 98% сумарного хлорофілу хлоропластів, які фрагментували.
Біохімічні методи досліджень.
Концентрацію хлорофілів a і b в ацетонових екстрактах визначали за вимірюванням оптичної густини на трьох довжинах хвиль на спектрофотометрі "Spekord M" (Німеччина) . Обчислення проводили за формулами Arnon (Arnon, 1949) і Vernon (Vernon 1960) [133]:
C (a) = 11,63 X D 665 - 2,39 X D 649 ;
C (b) = 20,11 X D 649 - 5,18 X D 665 (Vernon, 1960);
C (a+b) = ( D 652 X розведення )/ 34,5 ( Arnon, 1949);
Сумарну масу хлорофілу визначали за формулою: m=V?Ca+b
А Б С
1300g 10 хв 1000g 10 хв 1000g 10 хв
20000g 20хв 1300g 10 хв 1300g 10 хв
70000g 30хв 20000g 20хв 20000g 20хв
145000g30хв 40000g 20хв 40000g 20хв
70000g 30хв 145000g 30хв
145000g 30хв
Рис. 2.1. Схеми відбору фракції при фрагментації хлоропластів.
А - традиційна,Б,С - модифіковані.
Вихід хлорофілу розраховували по фракціям відносно початкового сумарного хлорофілу в суспензії хлоропластів:
?=1ma+b/2ma+b , де 1ma+b, - сумарний вихід хлорофілу, 2ma+b -сумарний початковий вміст хлорофілу в хлоропластах.
Кількісний вміст білку проводили по методиці Лоурі [133] з використанням реактиву Фоліна. Зразки не очищували від барвника, тому після обробки вимірювався показник поглинання на спектрофотометрі на довжині хвилі 750 нм, на якій хлорофіл майже не поглиниє. Вміст білку в зразках визначався по кривій калібровки, яку було побудовано шляхом використання розчинів з відомими концентраціями білку бичачого альбуміну.
Електрофорез хлорофіл-білкових комплексів проводили у поліакриламідному гелі [Laemmli, 1970]. Розподільний гель містив 12 % акріламіду, 0,1% бісакріламіду, 6 М сечовину, 0,375 М Tris-HCl (pH 8,9), 0,003 % персульфату амонію, 0,0003 % TEMED. Концентруючий гель містив 8 % акріламіду, 0,1 % бісакріламіду, 6 М сечовину, 0,175 M Tris-HCl (pH 6,8), 0,003 % персульфату амонію, 0,0003 % TEMED.
Зразки, що містили 5мкг хлорофілу, інкубували 16 годин при кімнатній температурі з додаванням 1/6 об'єму буфера, який в кінцевому об'ємі складався з 2% SDS, 3% гліцерину. Перед інкубацією в зразки додавали меркаптоетанол до кінцевої концентрації в зразках 10 %.
Електрофорез проводили з використанням Tris-glycine буферної системи за методикою Лаеммлі [132]. Потужність електричного току при електрофорезі складала 1,5 W на пластину.
Після проведення електрофорезу гель поміщали на 30 хвилин в розчин для фіксації білків, видалення зайвої води та вимивання сечовини. Цей розчин складався з 10% оцтової кислоти та 30% етилового спирту в воді. Після того гель фарбували органічним барвником Brilliant Blue R в водному розчині 10 % оцтової кислоти з додаванням 30% етанолу 12 годин при кімнатній температурі. Обезбарвлювання гелю проводили в водному розчині, що містив 10% етанолу та 10% оцтової кислоти.
Після одмивання зайвої фарби гелі висушували на склі між двома пластинками целофану при кімнатній температурі. Ці зразки накопичували та зберігали для подальшого аналізу.
Висушені пластинки гелю сканували на сканері "Mustek ScanExpress 12000P", реєстрограми обробляли за допомогою комп'ютерної програми обробки гелей "ScnImage".
Для ідентифікації смуг використовували суміш маркерних білків фірми "SIGMA", USA. Суміш, яка містила такі білки з відомими