РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для оцінки стану системи імунітету можуть використовуватись лабораторні тести різного рівня. Найбільш часто визначають вміст цитокінів в сироватці крові, а також продукцію цитокінів in vitro лейкоцитами донорів у відповідь на стимуляцію. Важливим є показник спонтанної продукції цитокінів Т-лімфоцитами, що характеризує ступінь активації клітин в організмі людини. Саме визначення спонтанної та індукованої препаратом продукції цитокінів Т- хелперами 1, 2 та 3 типів ми використовували для оцінки впливу препарату Манакс на імунокомпетентні клітини.
2.1. Загальна характеристика здорових донорів і хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз
Нами для проведення досліджень in vitro вивчались клітини периферичної крові практично здорових осіб (донорів), які проживають в м.Києві. Крім того, досліджували продукцію цитокінів та вплив на неї Манаксу у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз, які обстежувались та лікувались в Інституті урології та нефрології АМН України (директор - академік АМН і НАН України, д.м.н., професор О.Ф.Возіанов).
Мікробіологічні дослідження для діагностики хламідійної інфекції були проведені в лабораторії мікробіології, вірусології та мікології Інституту урології АМН України (зав. лабораторією д.м.н., професор А.В.Руденко).
Досліджувались зразки різного патологічного матеріалу - зішкряби із слизової уретри, цервікального каналу, піхви, а також секрет передміхурової залози, еякулят і сеча пацієнтів, які звернулися з приводу запальних захворювань сечостатевої системи.
Відомо, що мікробіологічна діагностика при підозрі на хламідійну інфекцію здійснюється в двох основних напрямках:
* Виявлення в досліджувальному матеріалі збудника, його антигенів або специфічних фрагментів ДНК;
* Виявлення специфічних сироваткових імуноглобулінів, обумовлених персистенцією Ch.trachomatis.
Для комплексної діагностики хламідіозу проведене мікроскопічне дослідження біологічного матеріалу, використовувався метод прямої імунофлуоресценції (ПІФ), серологічні дослідження (ІФА).
При використанні бактеріоскопічного методу при світловій мікроскопії у пофарбованому по Романовському-Гімзе препараті виявляли тільця хламідій. Елементарні тільця - невеликі утворення округлої форми (0,15 - 0,3 мкм), пофарбовані в рожевий або червоний колір, розташовані переважно позаклітинно. Ретикулярні тільця - більші утворення (0,5 -1,5 мкм). Вони розташовані внутрішньоклітинно, навкруги ядра епітеліальної клітини у вигляді скупчень, та пофарбовані від голубого до темно-синього кольору.
В основі методів імунологічної діагностики лежить взаємодія специфічних моноклональних антитіл з ліпополісахаридним антигеном хламідій. В біологічному матеріалі виявляється родоспецифічний антиген хламідій реакцією прямої імунофлуоресценції (ПІФ), імуноферментним аналізом (ІФА). Пряма ідентифікація хламідій флуоресцийованими моноклональними антитілами (ПІФ) проти основного білка зовнішньої мембрани та ліпополісахаридів (ЛПС) C. trachomatis дозволяє виявити як включення хламідій внутрішньоклітинно, так і одиничні позаклітинні елементарні тільця.
В реакції імуноферментного аналізу досліджували сироватку крові на наявність антитіл класу IgA, IgM, IgG до антигенів C.trachomatis диагностичною імуноферментною тест-системою "Хлами-Бест C.trachomatis", яка являє собою набір, головним реагентом якого є очищений білковий антиген Ch.trachomatis. Діагностичні титри для IgA - 1:100, IgM - 1:100, IgG - вище 1:100.
При використанні методу ПЦР для діагностики урогенітального хламідіозу паралельно досліджували епітеліальні зішкряби уретри, цервікального каналу, секрету передміхурової залози і еякулят на наявність в них ДНК Ch.trachomatis методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням видоспецифічних праймерів Ch.trachomatis, M.hominis, U.urealyticum, G.vaginalis (реактиви та обладнання виробництва фірми "ДНК-Технология", Москва, Росія).
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) основана на тому, що в досліджуваний зразок матеріалу вносять синтезовані нуклеотидні послідовності - праймери, які можуть комплементарно взаємодіяти з геномною ДНК або РНК інфекційного агенту. Попередньо ідентифікований матеріал обробляють термічно. Це призводить до денатурації двохспіральної ДНК, яка стає доступною для взаємодії з двома праймерами, комплементарними визначеній зоні геному. Здійснюючи повторні цикли денатурації і ренатурації, створюємо умови для розмноження (ампліфікації) частини ДНК до визначеної кількості, достатньої для виявлення. Межі нормальних значень вказаних параметрів були отримані на основі результатів дослідження 25 здорових донорів відповідного віку.
Дослідження цитокін-продукуючої активності імунокомпетентних клітин проведені у 75 хворих з підтвердженим (за допомогою вищезгаданих методик) діагнозом "хронічний сечостатевий хламідіоз"; контрольну групу складали 60 здорових жителів Києва. Серед пацієнтів було 40 чоловіків та 35 жінок. Вік хворих - від 19 до 38 років, в основному- 25-30 років (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Розподіл хворих на ХССХ, у яких вивчений стан цитокін-продукуючої активності імунної системи, та контрольної групи здорових донорів за віком
ВікКількістьХворі на хламідіоз Здорові донориабс. кількість%абс. кількість%18-252533%1525%26-303040%2643%31-351217%1322%? 35810%610%Всього75100%60100%
Клінічно майже всі 75 пацієнтів з підтвердженим діагнозом "хламідіоз" скаржились на слабкість, швидку стомлюваність; 40% - на болі внизу живота; 60% - на болі, різі при сечовипусканні; 50% - на виділення слизу із уретри.
20% пациієнтів звернулись за медичною допомогою з приводу урогенітального хламідіозу вперше, 80% хворих лікувались з приводу даного захворювання раніше, попередні методи лікування були неефективні. В анамнезі жінки в більшості випадків були на спостереженні декілька років у гінеколога з приводу хронічних за