РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Для досліджень використовувалась плазма крові людини. Забір крові здійснювали з локтьової віни у об'ємі 5 мл у 45 умовно здорових донорів (1 група), 21 хворого на ССД (2 група) та 32 хворих на гострий QІМ (3 група). Характеристика груп за віком та статтю наведена у табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Загальна характеристика досліджуваних груп
Група
Жінки
Вік у роках
(M±m)Чоловіки
Вік у роках
(M±m)Здорові донори
(1 група, n=45)27від 21 до 71 (46,00±2,87)18від 38 до 71
(50,67±2,21)Хронічний запальний процес
(2 група, n=21)21від 17 до 51
(39,89±4,43)--Гострий
запальний процес
(3 група, n=32)9від 53 до 78
(67,17±3,84)23від 33 до 77
(56,08±2,45)
Гострий QІМ та ССД розглядали як модель для вивчення стану та біологічної активності ФН за умов відповідно ГЗП та ХЗП у сполучній тканині людини. Загальною ознакою захворювань є порушення мікроциркуляторного русла, що є мішенню та в той же час ареною патологічного процесу [26, 16]. Рандомізовані за міжнародними стандартами зразки крові пацієнтів 2 та 3 груп були люб'язно надані співробітниками кафедр госпитальної терапії №1 та №2 Дніпропетровської державної медичної академії.
Наявність запального процесу була підтверджена у клінічній лабораторії за показниками ШОЕ, фібриногену, абсолютної кількості лейкоцитів, інтерлейкінів. У 2 групі показник ШОЕ складав 15,45±3,60 мм/ч. У 3 групі при надходженні до лікарні рівень фібриногену складав 3,86±0,12 г/л, показник абсолютної кількості лейкоцитів - 9,71±0,35 Г/л, рівень IL-6 - 35,27±4,76 пг/мл.
У 3 групі забір крові та подальші дослідження проводили тричі: при надходженні до лікарні, тобто до початку тромболітичної терапії альтеплазою і стрептокіназою згідно стандартній схемі, після закінчення активної антитромбінової терапії з використанням нефракціонованого та низькомолекулярного гепарину на 8 добу захворювання та наприкінці госпитального періоду на 21 добу від початку захворювання згідно міжнародній програмі досліджень "Extract TIMI 25".
Біохімічні дослідження було проведено з використанням хімічно чистих реагентів фірм Sigma (США), Serva (США), Amersham Pharmacia Biotech Limited (Швеція), DAKO (Данія), Merk (Германія), Chemicon (США), Chemapol (Чеська республіка), Сhemotech (Естонія), Гамалея (Росія), Лектинотест (Україна), СінБіас (Україна).
2.2. Виділення фібронектин-імуноглобулінових комплексів
Виділення комплексів ФН-IgG плазми крові проводили за допомогою афінної хроматографії на протеін-G-сефарозі НР фірми Amersham Pharmacia Biotech Limited (Sweden) та желатін-агарозі фірми Сhemotech (Естонія) і Sigma (США). На рис. 2.1 представлено основні етапи цього процесу.
Плазму у об'ємі 1мл наносили на колонку розміром 0,7х2,5см, що заповнена протеїн-G-cефарозою. Білки, що не зв'язались з протеін-G-сефарозою, віддаляли забуференим фізіологічним розчином (ЗФР), що містив
Хроматографія на
протеїн-G-сефарозі
Елюція гліцін-HСl - 0,1М, рН 2,8, Хроматографія на
Діаліз проти ЗФР, 14 годин желатін-агарозі
Хроматографія на Елюція трис-HCl -50мМ,
желатін-агарозі pH 7,4, що містить
NaCl - 0,5М
Елюція трис-HCl - 50мМ, pH 7,4,
що містить NaCl - 0,5М Елюція трис-HCl - 50мМ,
pH 7,4, що містить
NaCl - 1М
Елюція трис-HCl - 50 мМ, pH 7,4,
що містить NaCl - 1М Елюція трис-HCl - 50мМ,
pH 7,4, що містить
сечовину - 4М,
Елюція трис-HCl - 50mM, pH 7,5, діаліз проти ЗФР, 6 годин
що містить сечовину - 4М,
діаліз проти ЗФР, 6 годин
Рис. 2.1 Схема отримання вільного фібронектина та фібронектин-імуноглобулінових комплексів. Примітки: 1. F1 - білки, що не містять IgG; 2. F2 - імунні комплекси; 3. F3 - F5 - білки, що не зв'язуються або слабо зв'язуються з желатином; 4. F6 - ФН, зв'язаний з IgG; 5. F7-F9 - білки, що не зв'язуються або слабо зв'язуються з желатином; 6. F10 - вільний ФН.
сіль дінатрієва етілендіамін-N, N, N, N-тетраоцтової кислоти (ЕДТА) - 1мM, ФМСФ - 0,5 мM, NaN3 - 0,02%. Елюцію проводили глицин-НСl буферним розчином - 0,1 М, рH 2,8, ЕДТА - 1мM, фенілметилсульфонілфлорід (ФМСФ) - 0,5 мM, NaN3 - 0,02%, з послідуючою нейтралізацією NaOH - 1М у співвідношенні 1:10. Максимальна швидкість елюції становила 0,28 мл/хв, об'єм фракцій - 1 мл. Оптичну густину білку у фракціях вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 280 нм (рис. 2.2).
Рис. 2.2 Профіль елюції фракцій, що отримані після хроматографії на протеїн-G-сефарозі.
Фракції білків, що не зв'язалися з носієм, збирали та позначали як F1. Елюат діалізували проти ЗФР протягом 14 годин, збирали та позначали як F2.
Для отримання комплексів ФН-IgG 1,8 мл фракції F2 наносили на колонку з желатин-агарозою (0,9х2,0см) і залишали для сорбції на 20 хвилин. Віддалення білків, що не зв'язались з носієм, робили за допомогою ЗФР, що містив ЕДТА - 1мM, ФМСФ - 0,5 мM, NaN3 - 0,02%. Слабо зв'язані фракції білк