Глава 2.
ОбъектЫ и методы исследований
Работа выполнялась на базе кафедры микологии и фитоиммунологии Харьковского
национального университета им. В.Н. Каразина в период 1997-2005 гг. Ряд
исследований проводился на базе кафедры химической метрологии Харьковского
национального университета им. В.Н. Каразина, а также Опытного хозяйства
«Элитное» Института растениеводства им. В.Я. Юрьева УААН (Харьковский р-н,
Харьковская область).
Объектом исследований были 38 различных по устойчивости к гельминтоспориозам
сортов и гибридов ярового ячменя (Hordeum vulgare L.), любезно предоставленные
сотрудниками лаборатории иммунитета растений и лаборатории селекции ячменя
Харьковского института растениеводства им. В.Я. Юрьева УААН. Перечень
использованных сортов и гибридов ячменя, а также данные об их происхождении и
внутривидовой принадлежности приведены в приложении А. Также объектом
исследования были 60 моноспоровых изолятов гриба Bipolaris sorokiniana (Sacc.
in Sorokin) Schoem., выделенные нами из инфицированных листьев, корней и семян
ярового ячменя (по 20 каждого типа).
Отбор инфицированных грибом Bipolaris sorokiniana растений для выделения чистых
культур возбудителя и проведения всех последующих лабораторных исследований
производился на базе Опытного хозяйства «Элитное» Института растениеводства им.
В.Я. Юрьева УААН (Харьковский р-н, Харьковская область). Почвенно-климатическая
характеристика Опытного хозяйства «Элитное» в период проведения исследований
приведена в приложении Б.
Для выделения моноспоровых изолятов, отобранные в полевых условиях фрагменты
растений с признаками поражения B. sorokiniana промывали стерильной водой,
раскладывали в чашки Петри на увлажненную дистиллированной водой фильтровальную
бумагу и инкубировали в термостате при температуре 250С на протяжении пяти
суток. Отсев моноспоровых изолятов производился с использованием бинокулярной
лупы МБС-9 путем захвата отдельных конидий гриба микробиологической иглой и
перенесения их на агаризованную среду Чапека в чашки Петри. Оценку чистоты
полученных культур производили с помощью микроскопа. Для дальнейшего
исследования были использованы лишь генетически однородные изоляты, колонии
которых не расщеплялись на сектора с различной консистенцией и окраской
мицелия, а также активностью спороношения [86; 177]. Особенности выделения
изолятов из различных органов растения-хозяина описаны в третьей главе
настоящей работы.
Гриб культивировали на агаризованной среде Чапека (выделение и сохранение
культур, а также изучение морфолого-культуральных свойств),
сахарозно-аспарагиновом агаре с дрожжевым экстрактом (получение спор для
искусственного заражения растений) и жидкой среде Чапека (изучение активностей
ферментов и токсигенных свойств) [126].
Морфологические особенности спор патогена (характер септированности, длину и
ширину) определяли с помощью микроскопа МБИ-3 при увеличении в 900 раз. Замеры
производили с помощью окуляр-микрометра. Для каждого моноспорового изолята
анализировали параметры 300 спор [86].
Для изучения паразитических свойств моноспоровых изолятов B. sorokiniana были
отобраны 30 изолятов гриба (по 10 из листьев, семян и корней). В качестве
дифференциаторов нами были использованы 9 сортов и гибридов ярового ячменя,
отличающиеся по устойчивости к темно-бурой пятнистости: Сложный гибрид 6729
(Мексика), Темп (Россия), Одесский 115 (Украина), Tregal CI6359 (США), SV 89300
(Швеция), Kraaj 71-509 (Нидерланды), Вауег С15599 (Дания), Excel (США) и Line
TR-226 (Канада).
Споровую суспензию B. sorokiniana для проведения искусственного заражения
растений получали из культур гриба возрастом 9 суток, выращенных на
сахарозно-аспарагиновом агаре в чашках Петри [126]. Титр конидий в суспензии,
используемой для инфицирования растений, составлял 2500 шт/мл. Приготовление
суспензии нужной концентрации производили с помощью гемоцитометра Горяева [3;
482].
При проведении искусственного заражения, отрезки листьев 10-ти суточных
проростков каждого сорта и гибрида ячменя длиной 2 см раскладывали в чашки
Петри на предварительно увлажненную дистиллированной водой фильтровальную
бумагу. Затем на каждый отрезок листа с помощью автоматической пипетки
наносилось по 0,025 мл споровой суспензии гриба. Чашки Петри с отрезками
листьев инкубировали в светоустановке «Флора» на протяжении пяти суток с
суточным периодом освещения 16 часов (освещенность 800 люкс, температура 22-240
С) [3; 161; 71; 153; 278; 279; 355].
Показателями агрессивности изолята служили активность некротизации тканей
инфицированного растения и интенсивность спорообразования гриба на отрезках
листьев ячменя. Реакцию сорта на заражение патогеном учитывали на 5 сутки после
инокуляции [3; 68; 71; 109; 153; 279; 355; 370].
Развитие некроза учитывали по 4-бальной шкале, где балл 1 – точечные некрозы
без хлороза; балл 2 – некротические пятна с хлоротичным окаймлением или без
хлороза, не распространяющиеся по отрезку листа; балл 3 – некротические пятна с
хлорозом, распространяющиеся по отрезку листа; балл 4 –некротизирован весь
отрезок листа. Балл 0 в использованной шкале отсутствует, поскольку абсолютно
непоражаемых сортов при лабораторном методе тестирования выявить не удаётся [3;
68; 153; 279; 370].
Интенсивность спорообразования B. sorokiniana на отрезках листьев определяли
методом смывания конидий возбудителя 0,0001% раствором Твина-80 и последующего
подсчета количества спор в суспензии с помощью гемоцитометра Горяева. Согласно
общепринятой методике, в работе анализируются усредненные значения количества
спор в пересчете на один отрезок листа [86; 368; 482].
- Киев+380960830922