2
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ...............................................................4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Бактериологический анализ мяса и мясопродуктов при ветеринарносанитарной экспертизе и сертификации...................................7
1.2. Сравнительная оценка методов ДНК-диагностики при индикации и идентификации микроорганизмов.........................................13
1.2.1. Гибридизация нуклеиновых кислот................................13
1.2.2. Амплификация генов.............................................30
2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.Цель и задачи исследований........................................39
2.2.Объекты и методы исследований.....................................39
2.2.1 .Объекты исследований.......................'...................39
2.2.2.Методика бактериологического анализа мяса и мясопродуктов.......40
2.2.3.Контаминация мяса и мясопродуктов микроорганизмами..............42
2.2.4.Выделение и очистка тотальных ДНК для идентификации бактерий 42
2.2.5.Выделение и очистка ДНК с использованием гуанидинтиоизоционата....43
2.2.6. Мечение тритием бактериальных ДНК методом ник-трансляции 44
2.2.7.Мечение биотином бактериальных ДНК методом ник-трансляции 46
2.2.8. Мечение ДНК методом рассеянной затравки........................46
2.2.9. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции...............................................................48
2.2.10.ДНК гибридизация на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах с реперными, ДНК меченными тритием......................................49
2.2.11. Точечная ДНК гибридизация на мембранных фильтрах с биотинилированными ДНК................................................50
2.2.12. ДНК гибридизация с использованием тест-набора с ДНК-зондами, меченными биотином....................................................51
3
2.2.13. Методика полимеразной цепной реакции......................56
2.2.14. Статистическая обработка результатов......................57
2.3. Результаты исследований
2.3.1.Разработка модификации метода ускоренной идентификации бактерий на основе гомологии тотальных ДНК, меченных биотином.................58
2.3.2. Усовершенствование способа ускоренной индикации энтеробактерий в мясе и мясопродуктах на основе ДНК-зондов с возможностью дифференциации токсигенных форм..................................................67
2.3.3.Разработка модификации метода количественного определения бактерий, в мясе и мясопродуктах на основе ПЦР с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами......................................74
2.3.4. Сравнительная оценка результатов индикации и идентификации бактерий в мясе и мясопродуктах полученных, с помощью разработанных и
общепринятых методов..............................................82
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ............................84
ВЫВОДЫ............................................................93
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ..........................................95
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................96
ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................119
11
Escherichia coli - полиморфные палочки размером от 0,2-0,3 мкм и шириной до 0,8 мкм, с закруглёнными концами, чаще расположены одиночно. Имеются подвижные и не подвижные особи, некоторые образуют капсулу.
Эшерихии не устойчивы к высокой температуре: при 60° С гибель клеток наступает в течение 15 мин, а при 100 С0- моментально. Эшерихии более чувствительны к неомицину, полимиксину, нитрофурановым и сульфаниламидным препаратам, менее чувствительны к стрептомицину и пенициллину.
Кишечная палочка растёт и размножается при значительных колебаниях pH среды (5,0-8,0) и температуры (15-45 С). На плотных средах формируют слабо выпуклые полупрозрачные, сероватые колонии с ровными краями и блестящей поверхностью. В жидких средах образуется равнмерное помутнение и осадок (Лабинская, 1978; Краснобаев и др, 1995).
Кишечная палочка обладает термостабильным эндотоксином, вызавающим лихорадку, диарею, геморрагию, лейкопению с последующим лейкоцитозом.
Кишечную форму колибактериоза вызывают эшерихии содержащие термолабильный (LT) и термостабильный (ST) экзотоксины, которые активируют аденилатциклазы и гуанилатциклазы соответственно. Гены этих токсинов локализованы в плазмидах. В 1977 г у кишечной палочки были обнаружены шигеллоподобные токсины (SLT1 и SLT2) или веротоксины Гены, кодирующие эти веротоксины (VT) обнаружены в хромосомах в районе профага. Кроме того, бактерии Escherichia coli, содержащие токсин, могут вызывать геморрагический синдром. Прототип этих энтерогеморрагических форм Escherichia coli (Е.Н, Е.К) был впервые описан в 1982г, оказалось, что он принадлежит к серотипу 0157:Н7, со временем были обнаружены штаммы различных О-серотипов (Louie et al., 1994). <
Диапазон клинических симптомов, вызываемых эшерихиями, содержащими веротоксии, широк - от лёгких и тяжёлых гастроэнтеритов, до геморрагических колитов с проявлениями гемолитического, уремического синдрома или
12
тромбоцитолитического синдрома. При ослабленной иммунной системе возможен летальный исход. Продолжительность инкубационного периода зависит от степени инфицирования и обычно составляет от одного до трёх дней, иногда до восьми дней. В силу высокой устойчивости к воздействию факторов окружающей среды уровень инфицирования составляет приблизительно 100 бактерий. При этом главным источником инфекции являются продукты питания, получаемые из сырья крупного рогатого скота, овец, коз и молока. В особенности это мясо и мясные продукты, при хранении которых нарушался температурный режим.
Диагностика этих штаммов бактериологическим анализом требует соблюдения значительных мер предосторожности. Разработанные специфические тест-системы диагностики на основе иммунологических методов дают хорошие результаты в плане специфичности. Однако недостаточная чувствительность требует предварительного обогащения материала (March, Ratnam, 1989; Wright et al., 1994; Flint, Hartley, 1995).
Кишечная палочка, как и многие другие микроорганизмы, в ответ на различные стрессовые условия окружающей среды могет терять способность расти на средах, на которых она обычно культивируются. Некультивируемые формы бактерий не образуют колоний, что затрудняет обнаружение подобных колоний и их идентификацию при бактериологическом анализе (Госионов, 2000).
Таким образом, индикация и идентификация возбудителей инфекций классическими бактериологическими методами связаны с использованием многочисленных селективных питательных сред и различных субстратов. Это делает процесс идентификации длительным и трудоёмким.
Кроме того выращивание контаминирующих микроорганизмов на различных средах в условиях конкуренции не всегда приводит к адекватным результатам идентификации. Более того, идентификация in vivo трансформированных бактерий или искусственно генетически изменённых
- Київ+380960830922