Благодарности.
Автор выражает глубокую благодарность людям, чей вклад и поддержка при написании настоящего труда были неоценимы.
1. Стратонникову Александру Аркадиевичу.
2. Кустову Евгению Федоровичу.
3. Лилге Лотару.
4. Дуплику Александру Юрьевичу.
5. Конову Виталию Ивановичу.
6. Волковой Анне Ивановне.
7. Мееровичу Геннадию Александровичу.
8. Всему коллективу Лаборатории Лазерной Биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ РАН.
9. Всему коллективу отдела Оптоэлектроники департамента Биофизики университета Торонто.
10.Коллективу Эндоскопического отделения Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова.
Список примененных сокращений.
ФДТ - Фотодинамическая терапия
ФДЭ - Фотодинамический эффект
ФД - Флуоресцентная диагностика
ФС - Фотосенсибилизатор
ПЗС - Прибор с зарядовой связью
ЛФ - Локационный флуорофор
5-АЛК - 5-Аминоливулиновая кислота
ПП9, ПП1Х- Протопорфирин IX
МАЧС - Метод амплитудно-частотного сечения
СК - Спектралыгые координаты
МСК - Метод спектральных координат
4
Оглавление
Введение. .................................-.......................................................... 7
Вступление
Актуальность темы о
Цель исследования # 1 О
Задачи исследования 10
Научная новизна исследования ........•••м........... 11
Практическая з на чи лю сть. ...м........ м. .... ....мім. ...м.. м. «м....»••«••..••« ..*....««» ...... м...... ........ 12
Апробация работы 13
/ Публикации • нм*м«мммим*м«ммм«м*«мм(*м»«#*т*мммі«мт«мнмім«н«*т««*м«*««тмммм«ні«м*мім«м«ж«*мм«*мм«> 13
Объем и структура диссертации • ••ММ***М*МНМММ1М«МММ«М««М«М*«19М*««*ММ«ММ«««М«М«*««в»««М*«М«М*1М*МИМ 13 Глава 1. Обзор литературы ....................................................................................................14
1.1 Малоинвазивные методы 14
1.2 Лазерно-флуоресцентная спектроскопия в медицине................................................................ 15
13 Обзор ФДТ ......................................16
1.3.1 Положешіс дел в ФДТ.............................................................................................17
1.3.2 Фотосснсибилизатор..............................................................................................18
1.3.3 Физика фотодинамического эффекта................................................................................19
^ 1.3.4 Дозиметрия при ФДТ....................................................................22
1.4 Распространение света в биологических тканях.....................................................25
13 Малоинвазивные методики определения содержания сахара в крови человека...
.*ММ1М1М*....М..М..1*.М*МИ...1..»НМ.Н.М.*М...«.М.М.*....1.М..М.И«»...Н.>...1«..(.....М.....Н.«.|....Н....1.|.Н..НМ...«. 32
1.5.1 Методики множественной перфорации и постоянного автономного мониторинга 33
1.5.2 Электро-перфузия с химическим детектированием...................................................................34
1.5.3 ИК-спектроскопия основанная на био-имплантантах.................................................................36
1.5.4 ИК спектроскопия на поверхности кожи............................................................................36
1.5.5 Определение концентрации глюкозы на основе импедансиой радиоволиовой
спеетроскопин ................................................................................... 37
1.5.6 Химическое детектирование глюкозы на контактных линзах..........................................................38
-и<
1.5.7 Флуоресцентные сенсоры-имплантанты...............................................38
Глава 2. Система для определения плотности мощности излучения в биологических тканях при минимальной инвазии.................................................................. 40
2.1 Цели создания системы.......... ..................„............................„....40
22 Вступление • •••••»••••••г• •• ф.• ф ввФвфв.•• ф••• вв+ФФв•••»•*••••*..ив..в....*•.••••* ....... 41
2(3 ОПИСдНИС СИСТСМЫ 42
2.4 Флуорофоры .................... 45
25 Геометрия волокон 49
2.6 Методика расчета вклада флуорофоров в конечный спектр .... 50
2.7 Применение метода спектральных координат для декомпозиции спектра на парциальные доли.м...........................52
2.8 Пример решения уравнения для четырех ЛФ .......... «•ммт«(мм«м«ммимм«и«і*« 55
2.8.1 Относительные спектральные координаты нулевого порячка...........................57
2.8.2 Спектральные координаты первого порячка..........................................58
2.8.3 Спектральные координаты второго порядка..........................................60
2.8.4 Спектральные координаты третьего порядка.........................................61
Спектральные координаты четвертого порядка.............................................62
2.9 Методика декомпозиции спектров по спектральным координатам................. 63
2.10 Оптимизация методики декомпозиции спектра по спектральным координатам.
2.11 Модификация метода введением весовых коэффициешгов. .................................. 66
2.12 Калибровка прибора 68
2.13 Оценка изотропности распределения света в калибровочной установке 72
Глава 3. Измерения и валидация системы определения плотности мощности излучения в биологических тканях.........................................................................75
3.1 Измерение волокна с насечками без нанесения флуорофоров.................. ............. 75
3.2 Измерение одного ЛФ........... »•••М»*МММММММ*«ИНММ1*т«МММ««*«1МММ«ММ*М««««М»«М1«М**М*мММ 77
32 Модельные эксперименты —........................................................... 81
3.4 Опыты на экспериментальных животных ............................................. 86
Глава 4. Микроперфорация кожи с использованием лазера УЛО:Ег............................91
4.1 Введение 91
42 Исследование взаимодействия лазерного облучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости • >ИНИИ—Н«ММИ»ММЧ««М—1—НМЧЧЧ»——ММ»Ч>И1«М»НМ«МИМ»1»««М» 92
Глава 5. Измерение концентрации глюкозы в межклеточной жидкости..........................97
5.1 Методика определения содержания глюкозы в малых объемах жидкости .. 97
5.2 Калибровка тест полосок с помощью стандартных растворов глюкозы...........100
5.3 Измерение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости, полученной после лазерной микроперфорации кожи 105
5.4 Выводы...........—....—...------------------- -.................................107
Заключение..................................... ......................................108
Список публикаций............................................. ........................110
Список литературы.......................................................................113
Приложение 1. Метод спектральных координат..............................................126
Приложение 2. Математическое обеспечение системы дозиметрии концентрации глюкозы в межклеточной жидкости. Применение во (флуоресцентной диагностике..... 138
Введение.
Вступление.
Лазеры и лазерные технологии за последние три десятка лет вошли во все сферы человеческой деятельности. Одной из наиболее важных для общества областей применения лазеров является медицина [1, 2 ,3]. Благодаря высокой плотности мощности излучения и низкой расходимости пучка, лазер является наилучшим источником света для работы с оптоволоконной техникой. В зависимости от длины волны, плотности мощности и времени импульса излучения, лазер может быть как скальпелем с минимальной шириной «лезвия», так и аппаратом точечного выпаривания сколь угодно малых участков биологической ткани [4]. Высокая спектральная и пространственная плотность мощности позволяет использовать лазеры для измерения, как люминесцентных свойств ткани, так и таких тонких явлений, как доплеровский сдвиг спектра при отражении луча от движущихся молекул гемоглобина в кровеносных сосудах.
Ярким примером медицинского применения лазеров и флуоресцентной спектроскопии является бурно развивающаяся область фотодинамической терапии (ФДТ) [5] злокачественных новообразований. Для корректного проведения ФДТ одним из важнейших критериев является точная информация о пространственном и временном распределении света внутри биологической ткани, которое зависит от типа ткани, геометрии органа, его кровенаполненности, степе™ оксигснации [6], расположения сосудов [7], выгорания препарата [8, 9] и пр. и т.п. [10, 11].
Существует множество подходов, позволяющих либо в явном виде измерить, либо посредством математической модели [12 13] предсказать распределение плотности мощности внутри органа при ФДТ, однако, явное измерение зачастую неприемлемо по причине высокой степени инвазии в ткань,
что недопустимо при лечении онкологических заболеваний, а модельные приближения не всегда дают точный ответ, что чревато неэффективным ходом лечения.
В настоящей работе предлагается явный и, в то же время, малоинвазивный метод дозиметрии пространственного распределе1гия плотности мощности лазерного излучения в биологической ткани при ФДТ с использованием флуоресцентной спектроскопии [14, 15]. Низкая степень инвазии достигается за счет размещения нескольких флуоресцентных сенсоров на одном оптоволокне достаточно маленького диаметра (200мкм), чтобы не вызвать патологические процессы.
В качестве другого применения лазерно-флуоресцентной спектроскопии для малоинвазивной диагностики, в работе предлагается оригинальная методика измерения сахара в крови человека путем получения межклеточной жидкости при лазерной перфорации поверхности кожи с последующим флуоресцентным анализом капли на содержание глюкозы.
Актуальность темы
В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение малоинвазивные лазерно-спектроскопические методы исследования и диагностики различных патологий на различных тканях [16].
Одной из наиболее важных проблем является проведение точной пространственной дозиметрии и мониторинга во времени лазерного излучения внутри биологической ткани в процессе фотодинамической терапии [17]. Связано это в том числе с тем, что в последнее время в фотодинамической терапии все больше используются фотосенсибилизаторы сосудистого типа, имеющие относительно низкий контраст накоплшгия в опухоли относительно
нормальной ткани, в частности, Тукад, Визудин, пр. В этом случае лазерное излучение должно доставляться так и в том объеме, чтобы не повредить здоровые ткани, особенно жизненно важных органов. Особенную актуальность задача приобрела при все более широком внедрении ФДТ в лечение внутритканевых глубокозалегающих опухолей, соседствующих с жизненно-важными органами. К примеру, при лечении рака предстательной железы, который в современном мире выходит на первое место по частоте встречаемости среди онкологических заболеваний, с помощью ФДТ, очень важно, чтобы лазерное излучение не повредило расположенную рядом уретру, являющуюся легко подверженным повреждению органом. С другой стороны, если доза лазерного излучения окажется ниже пороговой величины для ФДТ в какой-либо части опухоли, то раковые клетки останутся неповрежденными и с высокой вероятностью вызовут рецидив, что недопустимо.
Другой актуальной проблемой, которой посвящена вторая часть работы, является малоинвазивная диагностика и мониторинг сахара в крови человека [18]. Широкая распространенность, ранняя инвалидизация и высокая смертності» больных определили сахарный диабет как острую медикосоциальную проблему современного мира. По данным ВОЗ, диабетом в той или иной форме страдают до 10% населения (приблизительно 4,6 млн. чел. в России по состоянию на 2000г) [19], и это число продолжает расти. Больные диабетом должны регулярно (мин 2 раза в сутки) измерять уровень сахара в крови. В настоящее время для этого используется метод прокола пальца ланцетом и анализ полученной капли крови. Эта процедура болезненна, неудобна, может вызвать проникновение инфекции, вид крови у многих (особенно у детей) вызывает стрессовое состояние. Актуальность предлагаемого в работе малоинвазивного и бескровного метода получения и анализа малых капель межклеточной жидкости не вызывает сомнений.
Цель исследования:
Основной целью диссертационной работы является развитие малоинвазивных методов дозиметрии пространственного распределения плотности мощности света при лазерном облучении биологических тканей в процессе фото динамической терапии и малоинвазивных методов дозиметрии содержания глюкозы в крови путем лазерной перфорации кожного покрова и анализа межтканевой жидкости с помощью лазерно-флуоресцентной спектроскопии.
Задачи исследования
Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:
1. Разработка, расчет, моделирование и экспериментальные исследования оптоволоконных флуоресцентных многосенсорных зондов с пространственно разнесенными флуорофорами для контроля пространственной плотности мощности лазерного терапевтического излучения с длиной волны 670 нм, возбуждаемых терапевтическим излучением и обеспечивающих за счет спектральных различий флуоресценции используемых флуорофоров возможность определения парциальных вкладов каждого из них.
2. Разработка физической модели (подхода) и математического алгоритма для расчета пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани из спектрально-флуоресцентных данных, полученных с оптоволоконных зондов.
3. Разработка многоканальной волоконно-оптической регистрирующей системы для изучения спектров излучения, выходящего из оптоволоконных зондов, и специального математического обеспечения дтя сбора и обработки получаемых спектральных данных.
4. Проведение модельных и экспериментальных исследований по определению плотности мощности лазерного излучения в тканях предстательной железы экспериментальных животных в процессе ФДТ.
5. Экспериментальное исследование взаимодействия с поверхностью кожи лазерного излучения с длиной волны 2.9 мкм, имеющего различную длительность и энергию импульсов.
6. Исследование методами лазерно-флуоресцентной спектроскопии процессов, происходящих при взаимодействии глюкозы в хроматографической бумаге, пропитанной специальными химическими реагентами.
7. Спектрально-флуоресцентное определение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости человека, полученной при лазерной перфорации кожи.
Научная новизна исследования
• Впервые проведены исследования, показывающие принципиальную возможность определения пространственного распределения света в биологической ткани с помощью моноволоконного датчика с 4-мя разными флуорофорами путем одновременной передачи флуоресцентного сигнала от них по одному оптическому волокну с возможностью последующей дешифровки вклада каждого из флуорофоров в общий спектр при возбуждении флуоресценции флуорофоров внутри биологической ткани изучаемым при ФДТ лазерным излучением низкой интенсивности.
• Впервые метод спектральных координат применен для расшифровки спектральных данных, получаемых с флуоресцентных зондов.
• Впервые обнаружен и изучен эффект образования капли внутритканевой жидкости на поверхности кожи человека из кратера, образованного при перфорации верхних слоев кожи лазерным импульсом.
• Методами лазерно-флуоресцентного анализа была изучена кинетика протекания реакции глюкозы, содержащейся в межклеточной жидкости, с химическими реагентами (Amplex Red, кислород, глюкозоксидаза, псроксидаза), результатом которой является сильно-флуоресцирующее вещество Резоруфин.
Практическая значимость.
Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, позволяют существенно улучшить качество дозиметрии ФДТ, тем самым, с одной стороны, уменьшить количество возникновений рецидивов, с другой стороны, не повреждать жизненно важные органы, находящиеся в непосредственной близости от опухоли. Созданная в рамках работы установка может служить прототипом системы для клинического применения.
Разработанная методика определения концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости может послужить основой для создания клинической диагностической .малоинвазивной системы измерения сахара в крови человека.
Разработанное в процессе выполнения данной работы программное обеспечение по получению и разностороннему анализу и формализации спектральной информации нашло широкое применение в различных областях спектроскопии и вошло в стандартную комплектацию серийного спектрометра ЛЭСА-01-Биоспек [20], успешно функционирует в более чем 20-и лабораториях России, а также Канаде, Словакии, США, Южной Корее, Польше.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Лазерные технологии в медицине XXI века» (С.-Петербург, 2001), Международном симпозиуме по биомедицинской оптике (Сан-Хосе, США, 2001), десятом Конгрессе Европейского Фотобиологического Общества (10 Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 6-11, 2003), Международной школе для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике (Saratov fall meeting 2005, Саратов, 2005), Международной конференции Photonics in Medicine, (Торонто, Канада, 13-14 сентября, 2005).
Публикации.
По результатам диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, включая патент РФ (№2258452 от 20.08.05 с приоритетом от 03.09.03), две статьи в рецензируемых изданиях, 3 статьи в иностранных журналах, 5 публикаций в материалах российских конференций и 3 публикации в материалах зарубежных конференций.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения и 5-и глав. Содержание диссертации изложено на 125 страницах, иллюстрировано 48-ю рисунками. Список цитируемой литературы включат 107 источников. Приводятся 2 приложения общим объемом 28 страниц, иллюстрированные 12-ю рисунками.
- Київ+380960830922