РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт дослідження.
В якості моделей для вивчення дії людського рекомбінантного ІФН-a2b та корового
олігоаденілату 2,5-АрАрА на механізми електричної збудливості нервових клітин
були використані лінії клітин людської нейробластоми IMR-32 та феохромоцитоми
щура РС-12.
Лінія клітин людської нейробластоми IMR-32 була отримана методом клонування
клітин однієї з найбільш злоякісних пухлин нервового гребінця. [87]. Лінія
клітин нейробластоми людини IMR-32 широко використовується як об'єкт для
біохімічних, фармакологічних та інших досліджень; може генерувати потенціали
дії, має натрієві, калієві та кальцієві струми [88]. Середній розмір клітин
складає близько 15 мкм. Здатність необмежено ділитися in vitro, великі натрієві
струми, наявність на плазматичній мембрані рецепторів до інтерферонів I типу
[89] та те, що це нейробластома людини (інтерферони – видоспецифічні), робить
лінію клітин нейробластоми людини IMR-32 зручним об’єктом для вивчення дії
людського рекомбінантного ІФН-a2b на властивості натрієвих каналів.
Лінія клітин феохромоцитоми щура PC-12 є клітинною лінією нейронального
походження. Ця нейросекреторна лінія являє собою трансформовані хромафінні
клітини, що були отримані методом клонування злоякісної пухлини мозкового шару
кори надниркової залози щура [90]. PC-12 є зручною моделлю для вивчення
процесів, що протікають у нервовій тканині, оскільки клітини PC-12 можуть
необмежено ділитися in vitro, диференціюватися під дією певних факторів та
набувати деяких властивостей, притаманних зрілому симпатичному нейрону:
утворювати нейрити, синтезувати та секретувати за допомогою екзоцитозу
нейротрансмітери [90]. Потенціалкерована калієва провідність клітин PC-12 є
домінуючою, що дозволяє використовувати ці клітини як адекватну модель для
дослідження впливу корового олігоаденілату 2,5-АрАрА на потенціал-залежність і
кінетичні характеристики калієвих струмів.
Культивування клітин нейробластоми IMR-32 здійснювалось за методикою, яка
описана в роботі [87]. Клітини IMR-32 вирощували в моношарі в пластикових
флаконах Карреля (25 мл) і пасивували через кожні 3-4 доби у співвідношенні
1:2. Середовище культивування: 85% RPMI-1640 (Sigma, USA, pH=7,4) с 10%
термоінактивованої ембріональної сироватки великої рогатої худоби (Sigma,
USA).
Культивування клітин феохромоцитоми PC-12 здійснюється за методикою, яка
описана в роботі [90]. Клітини РС-12 вирощували в моношарі в пластикових
флаконах Карреля (25 мл) і пасивували через кожні 3-4 доби у співвідношенні
1:3. Середовище культивування: 85% RPMI-1640 (Sigma, USA, pH=7,4) с 10%
термоінактивованої конячої сироватки (Sigma, USA) та 5% ембріональної сироватки
великої рогатої худоби (Sigma, USA).
Культури клітин вирощували в СО2-інкубаторі в зволоженому газовому середовищі з
5% СО2 при температурі +370С. Для досліджень клітини механічно знімали з
флакона в кінці лагперіода (приблизно 24 години), поміщали в пластикові чашки
Петрі (5мл) та культивували близько однієї години для прикріплення клітин до
субстрату чашки. Перед дослідженнями культуральне середовище замінювалося на
відповідний розчин.
Потенціал спокою для клітин людської нейробластоми IMR-32 в середньому складає
-38±11 мВ і для більшості клітин знаходиться в межах від –30 мВ до –60 мВ.
Натрієвий струм спостерігається більш ніж у половини клітин і блокується 0,5
мкМ ТТХ. Вони мають низьку щільність натрієвих каналів: максимальна натрієва
провідність складає близько 2 мСм/см2. При підтримуючому потенціалі –80 мВ та
деполяризації до +60 мВ його амплітуда знаходиться в межах від 50 до 960 пА.
Максимальна провідність складає 11,7 нСм. Для активації половинний потенціал
дорівнює 41,6 мВ, «нахил» - 3,9 мВ. Постійна часу активації залежить від
мембранного потенціалу і складає від 0,34 мс при –30 мВ до 0,09 мс при 20 мВ.
Для інактиваційної кривої половинний потенціал дорівнює -81 мВ, «нахил» – 9,7
мВ. Інактивацію не можна розділити на швидку та повільну складові. Постійна
часу інактивації також залежить від мембранного потенціалу і складає від 0,74
мс при –30 мВ до 0,44 мс при 20 мВ [91].
У клітинах IMR-32 присутній калієвий струм затриманого випрямлення [91]. При
мембранному потенціалі –10 мВ провідність при 6 мМ зовнішнього калію складає
3,3 нСм, а при 145 мМ – 5,7 нСм. Для кривої активації половинний потенціал – 17
мВ, «нахил» – 14 мВ. Постійна часу активації залежить від мембранного
потенціалу і складає від 16 мс при мембранному потенціалі 0 мВ та
підтримуваному потенціалі –60 мВ до 26 мс при мембранному потенціалі 10 мВ та
підтримуваному потенціалі –80 мВ. Час затримки активації також залежить від
мембранного потенціалу і знаходиться в межах від 3,1 мс при мембранному
потенціалі 0 мВ та підтримуваному потенціалі –60 мВ до 2,4 мс при мембранному
потенціалі 10 мВ та підтримуваному потенціалі –80 мВ. Спадаючу частину
калієвого струму можна апроксимувати сумою двох експонент. Постійні часу
інактивації також залежать від потенціалу мембрани і складають 1-2 с та 10 с
відповідно [91].
Кальцій пригнічує калієвий струм. Наявність 10 мМ тетраетіламонію пригнічує
калієвий струм вдвічі. 1 мМ 4-амінопередину зменшує калієвий струм у чотири
рази і збільшує постійну часу активації з 14.5 мс до 33.7 мс [91].
У клітинах IMR-32 є 3 типи Са2+-струмів: один T-типу і два - L- та N-типу.
Ca2+-струми T-типу активуються при потенціалі мембрани –50 мВ, мають
потенціал-залежну інактивацію з часом повної інактивації – 100 мс. Ці струми
нечутливі до 3.2 мкM w-конотоксину чи 40 мкM Cd, мають меншу чутливість до Ni
та амілориду, ніж T-типу Ca2+-струми в інш
- Київ+380960830922