РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ І ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
Дослiди проводилися на білих нелінійних щурах-самцях, яких утримували на стандартному рацiонi вiварiю. До кожної експериментальної групи було включено 5-6 тварин. Iнтоксикацiю кадмієм створювали шляхом трьохразового внутрішньошлункового введення тваринам хлориду кадмію в дозi 3,5 мг/кг маси тіла з iнтервалом в одну добу. Токсичне ураження печінки моделювали шляхом одноразового внутрiшньоочеревинного введення, на восьму добу від початку ураження, солянокислого гiдразину з розрахунку 90 мг/кг маси тiла [20].
Гістидин в дозі 2,0 мг/ кг (концентрація гістидину в крові) та відповідно гістидинат міді (0,98 мг/ кг) і гістидинат цинку (0,34 мг/кг) вводили внутрішньо-шлунково, з метою корекції виявлених порушень, через добу після кожного введення кадмію. При цьому виходили з біотичної дози мікроелементів. Металокомплекси синтезовано нами на кафедрі медичної хімії ТДМА з гістидину та гідроксидів металів, які брали в еквімолярних концентраціях. Унітіол вводили через годину після ін'єкції солянокислого гідразину в дозі 100 мг/кг [105].
Експерименти проводили на щурах таких вікових періодів: статевонезрілі (3-місячні, маса 70-120 г), статевозрілі (6-місячні, маса 150-220 г) та старі (18-місячні, маса 300 г і більше). Всіх тварин розділили на шість груп: I - iнтактнi, II - ураженi хлоридом кадмію та солянокислим гідразином, III - ліковані гістидином, IV - ліковані гістидинатoм міді, V - ліковані гістидинатом цинку, VI - ліковані унітіолом. Декапiтацiю пiд легким ефiрним наркозом проводили на 1-у, 4-у, 7-у та 10-у доби після введення гідразину. Для досліджень використовували плазму крові та гомогенат печінки.
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин".
2.2. Методи визначення активності процесів вільнорадикального
окиснення
2.2.1. Метод визначення вмісту малонового діальдегіду
Принцип методу полягає у здатності малонового діальдегіду при взаємодії з тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі утворювати забарвлений комплекс, інтенсивність якого адекватна вмісту МДА. Вміст МДА визначали в плазмі або 10 % гомогенаті печінки [31].
У звичайні центрифужні пробірки наливали по 1 мл дистильованої води, 1 мл 10 % гомогенату або 0,5 мл плазми, 2 мл 30 % р-ну трихлороцтової кислоти, 0,2 мл 5 моль р-ну HСl, 2 мл тіобарбітурової кислоти і витримували 15 хв на водяній бані при 100 ?С. Проби охолоджували , осад відділяли центрифугуванням при 3000 об/хв. Проби центрифугували 10 хв і вимірювали оптичну щільність верхньої фази на фотоелектроколориметрі КФК-3 при ?= 535 нм проти води. Розрахунок проводили, враховуючи коефіцієнт молярної екстинції для МДА, який дорівнює 1,56 ? 105 моль ? см-1.
Активність виражали в мкмоль/л у плазмі крові та мкмоль/кг в гомогенаті печінки.
2.2.2. Визначення вмісту дієнових та триєнових кон'югатів
Концентрацію дієнових (ДК) та триєнових (ТК) кон'югатів визначали за методом [35], який грунтується на тому, що екстраговані гептан-ізопропіловою сумішшю гідроперекиси мають відповідний максимум поглинання: ДК при ?= 232 нм, ТК - ?= 275 нм.
До 0,2 мл плазми або 10 % гомогенату додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу (1:1) і струшували 15 хв на лабораторному струшувачі АВ-30 с. Потім у пробірки додавали по 1 мл розчину НСІ (рН=2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і після відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий шар і вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-46 при ?= 232 нм та ?= 275 нм. Як контроль використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води замість досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ДК та ТК ліпідів проводили у відносних одиницях за формулою:
С= 10 ? Е ? V1 : V2 ум. од./ мл (для плазми) (2.1)
або С= Е ? V1 : V2 (для печінки), (2.2)
де Е - оптична щільність гептанового шару проби, V 1 - кінцевий об'єм гептанового екстракту (4 мл), V2 - об'єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
Вміст дієнових та триєнових кон'югатів виражали в ум.од./ л у плазмі крові та ум.од./ кг в гомогенаті печінки.
2.2.3. Визначення інтенсивності спонтанної та ініційованої
хемілюмінесценції
Для реєстрацiї спонтанного надслабкого випромiнювання ми використовували квантометричну установку, детектором в якiй служив фотоелектронний помножувач ФЕП-39А, термостатований при +15 оС.
Інтенсивнiсть ХЛ визначали при температурi 37 оС. Як блок iндикацiї використовувався електронно-обчислювальний пристрiй ПР-14М, за допомогою якого можна отримувати цифрову iнформацію в iмпульсах за певний час, а також вести графiчне вiдображення процесу на самописцi КСП-4. Перед i пiсля кожного дослiдження перевiряли фон установки. Інтенсивнiсть спонтанної ХЛ визначали таким чином: у термостатовану кювету вносили 4,5 мл 0,02 моль фосфатного буферу (рН = 7,4), додавали 0,5 мл плазми кровi (без гемолiзу) або гомогенату печiнки (1 : 10, на iзотонiчному розчинi) i записували рiвень свiтiння [13]. Iнтенсивнiсть спонтанної ХЛ виражали в ум.од.
Для пiдвищення iнформативностi методу використовували iнiцiювання ХЛ перекисом водню [13]. Дослiдження проводили в такiй послiдовностi: реєстрували спонтанну ХЛ, як описано вище; в кювету вводили 0,5 мл 3 % розчину перекису водню i реєстрували динамiку iнтенсивностi випромiнювання на самописцi до виходу кривої свiтiння на стацiонарний рiвень. Одночасно фiксували свiтлосуму iнiцiйованої ХЛ, яку вимірювали протягом 200 секунд і виражали в ум.од. За 1 ум.од. приймали кількість імпульсів за 1 с.
2.2.4. Метод визначення окиснювальної модифікації білків плазми крові
У процесі окиснювальної модифікації білків плазми утворюються альдегідні і кетонні групи. Останні взає