ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. 1. Методы исследования
Под наблюдением находилось 125 больных ЯБДК в стадии обострения и 19 практически здоровых лиц контрольной группы.
Всем пациентам проводилось объективное обследование, ультразвуковое, фиброгастродуоденоскопическое и рентгенологическое исследование внутренних органов, лабораторные исследования крови, мочи, кала.
Диагноз язвенной болезни устанавливали, основываясь на жалобах больных, данных анамнеза, а также объективного, инструментального и лабораторного исследования.
Желудочная секреция определялась по методике Н. И. Лепорского с применением в качестве раздражителя секреторного аппарата желудка гистамина сернокислого. Кислотность желудочного сока определялась в ммоль, рассчитывался дебит-час свободной соляной кислоты в ммоль. Параллельно у всех больных проводили рН-метрию желудочного сока с определением кислотности в корпусе желудка и ощелачивающей способности антрального отдела.
Переваривающая способность желудочного сока оценивалась по методике В. Н. Туголукова определением дебит-часа пепсина (базального и стимулированного) в мг. Наличие Нр определяли гистологическим, в мазках-отпечатках и уреазным методами.
Рентгенологическое исследование проводили по общепринятой методике с использованием взвеси сульфата бария с целью общего представления о состоянии желудка и двенадцатиперстной кишки, для определения локализации язвы, исключения патологии пищевода (дивертикулы, новообразования, стриктуры и т. д.).
Фиброгастродуоденоскопия проводилась с помощью эндоскопа ХР-20 фирмы "Olympus" с учетом показаний и противопоказаний, с диагностической целью и для контроля за результатами лечения. Биопсия слизистой оболочки для исследования проводилась из пилорического отдела желудка (В. М. Успенский, 1982).
Определение эндотелина-1 в плазме крови проводили иммуноферментным методом при помощи набора реактивов Endothelin-1 ELISA SYSTEM (code RPN 228) производства фирмы AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH (Англия).
Предварительную экстракцию ЭТ-1 выполняли на микроколонках Amprep C 18, 100 мг (code RPN 1900), олигопептид элюировали тонитрилом в 1% растворе трифторацетата. Для оценки эффективности экстракции одновременно с анализируемыми образцами экстрагировали контрольный образец ЭТ-1 в определенной концентрации (К). В качестве образца использовали стандарт из набора в концентрации 16 пмоль/л. После проведения анализа всех образцов сравнивали исходную и полученную концентрацию К и расчитывали фактор коррекции. В данной серии фактор коррекции составил 2,78 (эффективность экстракции 77%; экстракт из 1 мл плазмы был разведен в 0,250 мл буфера, для анализа использовали 0,1 мл, то есть фактор коррекции равен 1,3 ? 2,5 = 3,25). Диапазон измерений набора от 1 до 16 fmol / well / 2,49 - 39,87 pg / well / или 1-16 пмоль/ л анализируемой жидкости.
Уровень оксида азота (нитрита) в сыворотке крови определяли спектрофотометрически, методом Грисса- Илосвая (В. Д. Ванханен,
Г. А. Суханова, 1983) с сульфаниловой кислотой и 1-нафтиламином. Депротеинизацию сыворотки крови проводили 75 ммоль / л ZnSO4,
1,25 ммоль / л NaOH (Т. Nakamura., Y. Ohyama., H. Masuda).
Калибровочный график строили в диапазоне от 1 до 10 г / мл нитрита (1,43-14,3 мкмоль/ л).
Определение ТБК-активных продуктов в сыворотке крови проводили по методу Л. И. Андреевой (1988) с использованием тест-набора для определения перекиси липидов НПО-РЕАКОМ-ПЛЕКС (Россия).
Для анализа брали 0,3 мл свежей негемолизированной сыворотки крови и добавляли 3 мл рабочего раствора ортофосфорной кислоты, 1 мл раствора ТБК и 0, 1 мл растора сернокислого железа. Пробирки помещали в кипящую водяную баню на 1 ч, затем охлаждали в холодной воде и добавляли 4 мл бутанола, перемешивали и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Измеряли оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм (Е-оптическая плотность) против бутанола. Расчет продуктов, реагирующих с ТБК-активными продуктами, проводили с учетом коэффициента молярной экстинции МДА, равного
1,56 ? 10 5 моль / см.
А = Е оп. ? 10 6 ? 4 мл : 1,56 ? 10 5 ? 0,3 мл =
Е оп. ? 85,47, где А - содержание МДА мкмоль / л (ТБК-активные продукты).
Принцип метода основан на взаимодействии 5,5 дитиобис (2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) со свободными SH-группами, в результате чего происходит свобождение тионитрофенильного аниона, количество которого прямо пропорционально количеству свободных SH- групп белков, прореагировавших с ДТНБ.
Реактивы: буферный раствор ДТНБ, 0,02 ммоль / л.
Ход определения: в пробирку вносили 0,3 мл сыворотки крови и 3,0 мл ДТНБ, инкубировали 20-30 мин при комнатной температуре. Экстинцию измеряли на фотоэлектрокалориметре КФК- 3 при 412 нм против буферного раствора ДТНБ с добавлением 0,3 мл дистиллированной воды.
Результат расчитывали по формуле:
Кол-во SH-групп (ммоль / л) = А оп. ? 87
Определение восстановленного глутатиона (GSH) в сыворотке крови проводили также калориметрическим методом, описанным N. W. Tietz,
W. B. Sannders (1998).
Ход определения: к 0,2 мл сыворотки крови добавляли 0,3 мл физиологического раствора и 3 мл осаждающего раствора, инкубировали при комнатной температуре, затем центрифугировали в течении 5 мин. Определение GSH проводили по калибровочному графику при помощи стандартов GSH (готовится ex. tempore).
Cкорость регионарного кровотока в чревном стволе и его диаметр определяли методом эхограмм в режиме эхолокации и спектра потока крови с помощью имперсно-волновой допплерографии, выполненной на аппарате ALOKA-SSD-650.
Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики на персональном компьютере с применением стандартных программ корреляционного анализа с вычислением средних арифметических величин: M, m, ?.
Достоверность показателей оценивали по t - критерию Стьюдента, разницу считали достоверной при р ? 0,05. Применяли также корреляционный анализ