РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Трансляція еукаріотичної мРНК в ооцитах Xenopus
2.1.1. Одержання комплементарної мРНК.
HERG комплементарну РНК для інжекції в ооцити отримували шляхом in vitro
транскрипції з HERG кДНК у плазміді pSP64 (Sanguinetti 1995), використувуючи
mCAP-набір для кепування РНК (Stratagene), з наступною лініарізацією продукту
експресії в EcoRL.
2.1.2. Видалення ооцитів під наркозом.
В експериментах використовувались статевозрілі самиці Xenopus laevis, які
мають біля 30.000 крупних ооцитів діаметром приблизно 1 мм. Крупну самицю
анестезували, поміщуючи її на 5-30 хвилин в 0.1% розчин етиламінобензоату в
акваріумній воді, в якій утримувались тварини. Потім її поміщували на плоску
поверхню і робили невеликий надріз (~ 1см) з черевної сторони через вільно
прилягаючу шкіру і оболонку черевної порожнини з каудальної сторони тіла. В
результаті цієї операції відкривався доступ до яєчника, який розміщується в
черевній порожнині і складається з 16 долей.
Долі яєчника наркотизованої жаби (0,1% розчин етиламінобензоату) виділяли
оперативним шляхом, промивали в стерильному сольовому розчині OR-2 (в мМоль/л):
82,5 NaCl, 2 KCl,
Рис.2.1. Залежність часу обробки ооцитів ферментами
від температури. 1 – перший етап варки ооцитів в аліквоті ферменту, 2 – другий
етап.
1 MgCl2, 5 HEPES, pH 7,5 – NaOH) (Goldin 1992), та розділяли на окремі
фрагменти. На стінку черевної порожнини і на шкіру окремо наносили шви. Після
цього тварину залишали приходити до тями на протязі 1-3 годин в нахиленому
резервуарі, частково заповненому водою. При цьому слідкували, щоб знерухомлена
тварина не пересихала і мала змогу дихати повітрям, поки остаточно не
прокинеться.
2.1.3. Ізоляція ооцитів.
З метою одержання ізольованих ооцитів з відсутньою фолікулярною оболонкою,
фрагменти яєчника ретельно промивали в безкальцієвому розчині Барта (розчин
OR-2). Фрагменти яєчника піддавали ферментативній обробці в цьому же розчині з
додаванням колагенази (1 мг/мл, тип 1 “Сигма”) і інгібітора тріпсину (“Сигма”)
упродовж 40-90 хвилин в залежності від кімнатної температури з наступною
відмивкою від фермента. Розчин OR-2 з розчиненим ферментом розділяли на дві
аліквоти, відповідно “варка” ооцитів відбувалася у дві стадії. Обробка ооцитів
рочином ферменту наглядно ілюструється графіком, побудованим по нашим
емпіричним даним (рис.2.1), дві криві відповідають двом етапам “варки” ооцитів.
Непошкоджені ооцити 5-6 стадії розвитку відокремлювали та вивільняли з
фолікулярноЇ оболонки за допомогою пінцета і ножиць. Відібрані ооцити
інкубували при 18-20О С в розчині Барта (в мМоль/л): 88 NaCl, 1 KCl, 2,4
NaHC03, 0,3 Ca(NO3)2, 0,41 CaCl2, 0,82 MgSO4, 15 HEPES, pH 7,4), доповненому
гентаміцином (100 мг/мл), на протязі 5-7 днів. Кожний день проводилися зміна
розчинів і сортування клітин.
2.1.4. Мікроінжекція мРНК в ооцити.
Для мікроіжекцій мРНК використовувалася оригінальна установка з
напівавтоматичною подачею дозованого об’єму РНК в нанолітровому діапазоні в
ооцити (Бібігон, Київ). Установка складалась зі стереомікроскопа МБС-1,
мікроманіпулятора, джерела світла і мікронасосу. За допомогою системи з
мікронасосом набирали в мікропіпетку розчин РНК. Для виготовлення мікропіпеток
використовувались капілярні трубочки з зовнішнім діаметром 3 мм, з яких тягнули
мікропіпетки з діаметром кінчика не більше 20 мкм.
Спочатку в мікропіпетку набирали мінеральне масло, потім надчисту дистильовану
воду для того, щоб перевірити функціональність мікропіпетки, потім воду
випускали і набирали розчин РНК. Перед інжекцією мікропіпетки прокалювали при
200-300оС.
Кілька десятків ооцитів поміщували на підложку з канавками, зроблену з оргскла.
Ооцити розміщували в канавках, підложку занурювали в розчин Барта так, щоб він
накривав ооцити. Ооцити інжектувалися в вегетативну область. Після проникнення
мікропіпетки в ооцит, введення розчину РНК контролювали по положенню розділу
фаз масло-розчин РНК в мікропіпетці, а також по руху мембрани ооцита,
прилягаючої до мікропіпетки, під тиском інжектованого розчину РНК. В кожен
ооцит вводили приблизно 50 нл водного розчину РНК в концентрації 1мкг/1мкл.
Після мікроінжекції ооцити культивували в розчині Барта на протязі 4-15 днів
при температурі 18-200С. Зміну розчину проводили кожного дня, відбираючи
пошкоджені і неповноцінні ооцити, які відрізняються від нормальних по
нерівномірній пігментації.
2.2. Електрофізіологічний експеримент.
Електрофізіологічні експерименти проводилися на четвертий день після ін’єкції
мРНК в ооцити з використанням стандартної методики двохелектродної фіксації
потенціалу. Експериментальна установка складалася з рухомого столика з чотирма
камерами (з різними досліджуваними розчинами), мініатюрної платформи, на яку
поміщували ооцит, стереомікроскопа МБС-2, для візуального контролю введення
мікроелектродів в клітину в горизонтальній площині, виготовленого в нашій
лабораторії підсилювача, дозволяючого реалізувати фіксацію потенціалу при
величині струмів до 10 мкА, підсилювати відводимий сигнал в 1-500 раз,
компенсувати потенціал кінчика струмового електроду, а також компенсувати
перехідні процеси перезарядки ємності ооцита. Блок-схему підсилювача наведено
на рис. 2.2. Електрод для реєстрації мембранного потенціалу виготовлявся зі
скляних трубок з капіляром і мав опір 2-3 мОм. Електрод для пропускання струму
фіксації потенціалу виготовлявся з боросилікатного скла, мав опір 0,5-1 мОм.
Мікроелектроди з даними параметрами отримували за допомогою мікроковальні МЭ-4.
Контроль діаметра кінчика мікроелектродів та їх якості проводився під світловим
мі
- Київ+380960830922