РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работу выполняли в течение 1998-2001 гг. на кафедре микробиологии и вирусологии Крымского ГАУ.
Материалом для исследования служили культуры P.multocida (полевые и референтные штаммы). Полевые культуры P.multocida были изолированы бактериологическими методами от телят, заболевших пастереллезом. Референтные штаммы пастерелл были получены из музея живых культур кафедры.
Для культивирования возбудителя пастереллеза использовали элективные питательные среды - бульон по Хоттингеру и 5 % кровяной МПА. Поддерживали культуры в условиях лаборатории в течение 6-8 месяцев периодическими пересевами больших объемов инокулята на полужидком агаре (ПЖА) с интервалом 4-6 недель.
При необходимости сохранения бактериальных культур на более длительный срок использовали метод лиофилизации возбудителя в защитно-суспензионных средах высушивания.
Для изучения биологических свойств (определении LD50) полевых культур и референтных штаммов P.multocida использовали для заражения 240 беспородных белых мышей массой 16-18 г, 104 кролика породы шиншилла массой 1,5-1,8 кг, 96 короткошерстных морских свинок массой 250-280 г и 64 цыпленка 120-дневного возраста.
С целью получения диагностических пастереллезных сывороток гипериммунизировали референтными штаммами 36 кроликов породы шиншилла массой 3,0-3,5 кг. При изучении иммуносупрессивных свойств полевых культур P.multocida использовали 56 кроликов породы шиншилла массой 3,0-3,5 кг.
Провели бактериологическое исследование 300 образцов исследуемого биоматериала от павших, вынужденно убитых и клинически здоровых телят 1-6 месячного возраста. Для установления вирулентности полевых изолятов возбудителей бронхо-легочных заболеваний телят заразили 1224 беспородных белых мышей массой 16-18 г. Выделенные культуры бактерий изучали по общепринятым методикам. Видовую принадлежность бактерий устанавливали по определителю Bergey [141].
Приготовление защитно-суспензионных сред высушивания (по Файбич М.М., 1968).
Обезжиренное молоко, сахарозо-желатиновую среду (СЖ) и сахарозо-желатино-агаровую среду (СЖА) стерилизовали в аппарате Коха дробно, по 30 мин 3 дня подряд. СЖ среда содержала 10 % сахарозы и 1,5 % желатина на дистиллированной воде. СЖА среда дополнительно содержала 0,1 % агар-агара.
Среда высушивания с гидролизированным желатином состояла из 10 % сахарозы и 10 % гидролизированного желатина, для чего 20 % раствор желатины автоклавировали 3ч при 2 атм, затем отстаивали и фильтровали. Стерильные компоненты среды соединяли асептически.
Определение выживаемости лиофилизированных культур пастерелл. (по Аркадьевой З.А., 1983)
Жизнеспособность лиофилизированных препаратов изучали культуральным методом на 5% кровяном МПА и выражали в процентном отношении к исходной баксуспензии по формуле:
, где
Х - выживаемость лиофилизированных пастерелл в процентах;
а - количество КОЕ/см3 лиофилизированного препарата;
в - количество КОЕ/см3 исходной баксуспензии пастерелл.
Определение остаточной влажности лиофилизированных препаратов ускоренным методом (по Колесову С.Г., Чернецкому Ю.П., 1981).
Содержание остаточной влаги в препарате рассчитывали по формуле:
, где
Х - влажность препарата в процентах;
а - первоначальный вес пробы;
в - вес пробы после высушивания при 100?С в течение 60 мин.
Методика расчета времени генерации бактериальной культуры (по Елинову Н.П., 1977).
Каждая одиночная клетка бактерий при размножении образует 2 новые клетки, и следовательно в благоприятных условиях среды обитания такие клетки будут размножаться в геометрической прогрессии, т.е. экспоненциально.
Время генерации может быть рассчитано для ?g (число генераций) в экспоненциальной фазе роста по формуле:
, где (2.1)
Р - число клеток во времени t;
Ро - число клеток в нулевой точке отсчета времени;
2 - показатель экспоненциального увеличения числа клеток.
Определение биохимических свойств (по Вейант Р., Мосс У., Уивер Р. и др., 1999).
Биохимическую активность пастерелл изучали общепринятыми методами, исследовали состав гликолитических и протеолитических ферментов.
При определении способности микроорганизмов расщеплять сахара в качестве тест-объектов использовали следующие углеводы: глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, галактоза, арабиноза, трегалоза, ксилоза, инозит, салицин, рамноза, маннитол, сорбитол, дульцитол.
Углеводы добавляли в среду следующего состава: пептон - 10г, NaCl - 5г, вода дистиллированная - 1000 см3, 10 см3 индикатора Андреде. Среду стерилизовали автоклавированием 15 мин при 121?С, затем асептично добавляли необходимое количество углеводов (1 % в конечной концентрации). Углеводы предварительно стерилизовали в виде 10 % водных растворов текучим паром дробно, два дня по 30 мин.
Для изучения протеолитических свойств пастерелл провели определение сероводорода, индола, ферментов желатиназы, каталазы и уреазы, тесты на декарбоксилазы, оксидазную активность, восстановление нитрата, реакцию Фогеса-Проскауэра и пробу с метиловым красным.
Выделение культур пастерелл из патологического материала (по Геведзе В.И., 1989).
Для выделения P.multocida биологическим способом из кусочков паренхиматозных органов готовили суспензию на физиологическом растворе в соотношении 1:5-1:10. Суспензией в объеме 0,3-0,5 см3 заражали подкожно не менее трех белых мышей или одного кролика. Кроликов за несколько дней до заражения проверяли на пастереллоносительство методом провокации (по Розанову Н.И., 1952). В носовую полость кролика ежедневно в течение трех дней вводили по 0,2 см3 0,5% водного раствора бриллиантгрюна в каждый носовой ход. У пастереллоносителей через 10-24 ч после введения появлялся гнойный ринит.
За зараженными животными наблюдали 5 дней. Для выделения чистой культуры пастерелл кровь из сердца павших или агонирующих животных выс