РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ, ОБЛАДНАННЯ І МАТЕРІАЛИ
Робота виконана у 1994-2000 роках в Інституті епізоотології УААН.
Враховуючи особливості об'єкта (молекули БАР, міжмолекулярні комплекси органічних сполук, похідні та аддукти БАР у рідких сумішах та біоорганічних субстратах) та предмета (стан, структурні зміни і міжмолекулярні взаємодії БАР у рідких сумішах та біоорганічних субстратах, гомо- та гетероасоціати іонів, можливість фізико-хімічної характеристики молекул БАР у розчинах) досліджень, в ролі основного біофізичного експериментального методу використано МС, зокрема у такому її варіанті, як ПДМС.
Дослідження проводили на мас-спектрометрі біохімічному МСБХ-01 з іонізацією уламками поділу Cf-252 (АТ "SELMІ", м.Суми, Україна) [130]. На рисунку 2.1 наведено принципову схему приладу.
МСБХ-01 має такі аналітичні характеристики: діапазон молекулярних мас, що реально реєструються, від 1 до 20 000 а.о.м., роздільна здатність - 1000 по кластерах іодиду цезію, гранична чутливість - 1 пмоль для граміцидину С, точність визначення молекулярної маси ? 0,6 в діапазоні до 5500 а.о.м. і 0,1% для більш складних молекул.
У процесі роботи використовували прискорюючі напруги від +20 кВ до -20 кВ, об'єм накопичуваних даних подій розпаду Cf-252 (стартів) від 16000 до 300000, ширина каналу детектування 1 або 2 нс/канал, режим віднімання постійного фону. Кожен експеримент повторювали не менше 3-х разів. При створенні багатокомпонентних модельних систем для кожної серії експериментів попередньо знімали мас-спектри, окремих інгредієнтів. Моніторинг комерційних препаратів та модельних сумішей БАР проводили
7 8
10
5
9 ? 1
* * * 4 * * 7
Рис.2.1. Принципова схема мас-спектрометру МСБХ-01:
1 - радіоактивне джерело іонів (252Cf);
2 - позолочений диск із нанесеними зразками, на диск подається прискорюючий потенціал (прискорююча напруга від +25 до -25 кВ);
3 - прискорююча сітка, до якої подається "нульовий" потенціал;
4 - десорбовані іони у вакуумному безпольовому просторі труби дрейфу;
5 - стартовий детектор;
6 - стоповий детектор;
7 - підсилювач-формувач;
8 - блок управління і реєстрації даних;
9 - система забезпечення підтримання високого вакууму;
10 - електронний обчислювальний комплекс на базі комп'ютера ІBM.
від декількох днів до трьох років. На рисунках наведені мас-спектри, що були отримані за допомогою спеціальної комп'ютерної програми керування, накопичення та обчислення даних (МСБХ, версія 4.0/m). Мас-спектри реєструвалися і оброблялися комп'ютером, результати виводилися на монітор (або принтер) у графічному або табличному вигляді. Програма дозволила сформувати легку в оперуванні базу мас-спектрів речовин, що досліджувалися, та їх сумішей. В деяких експериментах використані такі можливості програми, як віднімання або додавання окремих спектрів, віднімання постійного і гладкого фону, автоматична нумерація та визначення питомої ваги піків та ін.). Ідентифікацію та оцінку стану БАР у сумішах, їх хімічну сумісність, аналіз компонентного складу субстратів різного походження, проводили за характером мас-спектрів, інтенсивностю та співвідношенням комплексу піків КМІ, аддуктів, асоціатів та похідних
У ПДМС-приладі використовується часопролітний мас-аналізатор, що становить собою еквіпотенціальний простір, в якому дрейфують іони, через різницю мас вони розділяються за швидкостями руху [93]. Іони, що утворилися в іонному джерелі, дуже коротким електричним імпульсом "вприскуються" у вигляді моноенергетичного "іонного пакета" через прискорюючу сітку в аналізатор. У процесі руху вихідний іонний пакет розшаровується на пакети, що складаються із іонів з однаковими значеннями m/z. Швидкість руху (t) відшарованих іонних пакетів і, відповідно, час їх прольоту через аналізатор довжиною L вираховується за формулою:
,
де V - прискорююча напруга, е - заряд електрона, m - маса іона. Сукупність таких пакетів, що поступають у детектор, утворює мас-спектр. Для сучасних приладів роздільна сила R=5000-10000. Час прольоту (Тпр) пов'язаний із m/z співвідношенням:
,
де А і В - константи, що залежать від прискорюючої напруги, довжини шляху дрейфу і часової затримки електронного лічильника. Ці коефіцієнти можуть бути знайдені емпірично (процес має назву калібровки шкали мас) за двома піками із заздалегідь відомими m/z, після чого стане відомим значення m/z будь якого іона, що становить пік з координатою Тпр на часопролітному спектрі.
Програма керування та обчислення даних передбачає автоматичну калібровку приладу за двома пікам із заздалегідь відомими значеннями m/z.
Об'єкти досліджень залежно від їх фізико-хімічних властивостей і завдань кожного конкретного експерименту, розчиняли у відповідно підібраних розчинниках: воді, слабих кислотах або лугах, етанолі, метанолі, ацетоні, диметилсульфоксиді, диметилформаміді або їх сумішах. При виборі розчинників зважали на такі фактори:
- по можливості, повна розчинність БАР, що досліджуються;
- хімічна інертність;
- добре змочування поверхні пробонесучого диску і утворення оптимальної форми плями-проби;
- максимальна чистота розчинника (марка чда або хч);
- зручність у роботі і мінімальна токсичність;
Після розведення у необхідних пропорціях або концентраціях зразки, в залежності від завдань досліду, витримували певний час при необхідних умовах (у холодильнику, t=+4?C чи при кімнатній температурі, t=+20? C від 1 доби до 3-х років) або відразу наносили на позолочений пробонесучий диск мікродозатором. Оптимальним є нанесення на один диск до 12 зразків по периметру